Ch.1 enzyme utilisés comme outils pour manipuler l'ADN Flashcards
Qu’ont amenées les techniques d’analyses de gènes?
Révolution permettant l’analyse de gènes individuels, leur régulation et l’organisation de génomes complexes
Qu’a permis la PCR?
Des applications dans de nouveaux domaines
Séquencage d’ADN
Qu’est ce que le clonage de gènes?
Que requiert-il?
Processus d’amplification qui requiert d’abord l’union de gènes avec un vecteur, puis une cellule hôte de manière à amplifier la molécule recombinante
Qu’est ce que la PCR?
Quels sont ses avantages en terme de matériel?
Processus d’amplification in vitro
-Pas besoin de vecteur ni de cellules vivantes
Comment fonctionne a PCR?
Une région génomique précise est amplifiée de manière à générer des milliers de copies de cette région à partir de seulement quelques molécules d’ADN
Pourquoi le clonage de gènes et la PCR sont importants?
- Produisent des échantillons purs de gène individuel
- Permettent l’étude de la structure des gènes
- Clonage permet la purification de ce fragment
- Chaque clone possède de multiples copies d’une seule molécules
Vrai ou faux
L’ensemble des clones obtenus contiennent de nombreuses molécules recombinante différentes
Vrai
Quel est l’avantage de la PCR par rapport au clonage?
Permet d’amplifier sélectivement et rapidement le gène désiré
Quelles sont les limitations de la PCR?
Les séquences de chaque coté du gène doivent être connues
La longueur de l’ADN pouvant être amplifier est limité
Vrai ou faux
Une fois isolé un gène est souvent inséré dans un vecteur spécialisé
Vrai
Quelles sont les étapes pour purifier de l’ADN cellulaire total?
- Une culture bactérienne est «grown» et «harvested»
- Les cellules sont enlevés et détruite pour avoir un extrait cellulaire
- L’ADN est purifier
- L’ADN est concentrer
Que veut dire «ADN pure»?
Non contaminé par des protéines et des polysaccharides et non dégradé
Comment peut on savoir que l’ADN n’est pas pure?
Poids moléculaire plus élevé
Quelles sont les différentes méthodes utilisées pour préparer un extrait cellulaire?
Donne un example pour chaque
L’ADN reste-t-il intact avec une de ces méthodes?
Physiques ou chimiques
P= écraser C= agents chimiques
Non
Quelle méthode est utilisée pour faire un extrait cellulaire chez E. coli?
Lysozyme en présence de EDTA pour briser la paroi cellulaire et du SDS pour la membrane
Quels sont les deux rôles du EDTA dans la préparation d’un extrait cellulaire?
- Affaiblir la paroi
2. Inhiber l’activité des enzymes intracellulaires dégradant l’ADN
Quels sont les rôles du SDS dans la préparation d’un extrait cellulaire?
- Dissocier les protéines membranaires
2. Inhiber l’activité des enzymes cellulaires
Quels sont les deux approches pour purifier de l’ADN à partir d’un extrait cellulaire?
a) Dégradation des contaminants par extraction avec phénol ou phénol : chloroforme (1:1) et digestion enzymatique
b) Séparation de l’ADN des contaminants par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions ou thiocyanate de guanidium et silice
Quels sont les deux enzymes utilisés dans la purification de l’ADN par dégradation des contaminants?
Protéase et ribonucléase
Vrai ou faux
Le phénol avec du chloroforme amène à une moins bonne séparation de la phase aqueuse et de la phase organique
Faux, meilleure
Quel est l’effet du phénol dans la purification de l’ADN?
Est-ce qu’un autre composé est ajouté par la suite?
Dénature protéine
Oui, RNase pure
Expliquer la purification de l’ADN par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions
Les molécules chargés négativement (ADN, ARN, certaines prots) se lient à la résine chargée positivement. Elles se détachent en présence de sels
Dépose l’extrait cellulaire sur la colonne puis on fait passer successivement 2 solutions de sels. 2eme plus concentrer = ADN, premiere = reste.
Éluat récolté par gravité ou centrifugation
Expliquer la purification de l’ADN par la méthode de thiocyanate de guanidium et silice
L’extrait cellulaire + thiocyanate de guanidium est déposé sur une colonne de silice, ADN colle à silice. Reste est enlever. Récupère l’ADN avec eau
Le thiocyanate de guanidium est aussi utilisé pour ____, parce qu’il laisse____
dénaturer prots, entrer l’eau dans les molécules