Ch.1 enzyme utilisés comme outils pour manipuler l'ADN Flashcards
Qu’ont amenées les techniques d’analyses de gènes?
Révolution permettant l’analyse de gènes individuels, leur régulation et l’organisation de génomes complexes
Qu’a permis la PCR?
Des applications dans de nouveaux domaines
Séquencage d’ADN
Qu’est ce que le clonage de gènes?
Que requiert-il?
Processus d’amplification qui requiert d’abord l’union de gènes avec un vecteur, puis une cellule hôte de manière à amplifier la molécule recombinante
Qu’est ce que la PCR?
Quels sont ses avantages en terme de matériel?
Processus d’amplification in vitro
-Pas besoin de vecteur ni de cellules vivantes
Comment fonctionne a PCR?
Une région génomique précise est amplifiée de manière à générer des milliers de copies de cette région à partir de seulement quelques molécules d’ADN
Pourquoi le clonage de gènes et la PCR sont importants?
- Produisent des échantillons purs de gène individuel
- Permettent l’étude de la structure des gènes
- Clonage permet la purification de ce fragment
- Chaque clone possède de multiples copies d’une seule molécules
Vrai ou faux
L’ensemble des clones obtenus contiennent de nombreuses molécules recombinante différentes
Vrai
Quel est l’avantage de la PCR par rapport au clonage?
Permet d’amplifier sélectivement et rapidement le gène désiré
Quelles sont les limitations de la PCR?
Les séquences de chaque coté du gène doivent être connues
La longueur de l’ADN pouvant être amplifier est limité
Vrai ou faux
Une fois isolé un gène est souvent inséré dans un vecteur spécialisé
Vrai
Quelles sont les étapes pour purifier de l’ADN cellulaire total?
- Une culture bactérienne est «grown» et «harvested»
- Les cellules sont enlevés et détruite pour avoir un extrait cellulaire
- L’ADN est purifier
- L’ADN est concentrer
Que veut dire «ADN pure»?
Non contaminé par des protéines et des polysaccharides et non dégradé
Comment peut on savoir que l’ADN n’est pas pure?
Poids moléculaire plus élevé
Quelles sont les différentes méthodes utilisées pour préparer un extrait cellulaire?
Donne un example pour chaque
L’ADN reste-t-il intact avec une de ces méthodes?
Physiques ou chimiques
P= écraser C= agents chimiques
Non
Quelle méthode est utilisée pour faire un extrait cellulaire chez E. coli?
Lysozyme en présence de EDTA pour briser la paroi cellulaire et du SDS pour la membrane
Quels sont les deux rôles du EDTA dans la préparation d’un extrait cellulaire?
- Affaiblir la paroi
2. Inhiber l’activité des enzymes intracellulaires dégradant l’ADN
Quels sont les rôles du SDS dans la préparation d’un extrait cellulaire?
- Dissocier les protéines membranaires
2. Inhiber l’activité des enzymes cellulaires
Quels sont les deux approches pour purifier de l’ADN à partir d’un extrait cellulaire?
a) Dégradation des contaminants par extraction avec phénol ou phénol : chloroforme (1:1) et digestion enzymatique
b) Séparation de l’ADN des contaminants par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions ou thiocyanate de guanidium et silice
Quels sont les deux enzymes utilisés dans la purification de l’ADN par dégradation des contaminants?
Protéase et ribonucléase
Vrai ou faux
Le phénol avec du chloroforme amène à une moins bonne séparation de la phase aqueuse et de la phase organique
Faux, meilleure
Quel est l’effet du phénol dans la purification de l’ADN?
Est-ce qu’un autre composé est ajouté par la suite?
Dénature protéine
Oui, RNase pure
Expliquer la purification de l’ADN par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions
Les molécules chargés négativement (ADN, ARN, certaines prots) se lient à la résine chargée positivement. Elles se détachent en présence de sels
Dépose l’extrait cellulaire sur la colonne puis on fait passer successivement 2 solutions de sels. 2eme plus concentrer = ADN, premiere = reste.
Éluat récolté par gravité ou centrifugation
Expliquer la purification de l’ADN par la méthode de thiocyanate de guanidium et silice
L’extrait cellulaire + thiocyanate de guanidium est déposé sur une colonne de silice, ADN colle à silice. Reste est enlever. Récupère l’ADN avec eau
Le thiocyanate de guanidium est aussi utilisé pour ____, parce qu’il laisse____
dénaturer prots, entrer l’eau dans les molécules
Quel est l’avantage principal d’utiliser la méthode de thiocyanate de guanidium et silice?
Peut être automatisé = traiter de nombreux échantillons à la fois
Comment les échantillons d’ADN sont-ils concentrés?
Par précipitation avec de l’éthanol
à -20 degré C en présence d’ions Na+ et 2 à 2.5 volumes d’éthanol 95%
C élevé = tige de verre
Dilué = centrifugation
Comment détermine-t-on la concentration et la pureté de l’ADN purifié?
Par mesure de l’absorbance à 260 et 280 nm en utilisant nanodrop
Vrai ou faux
Une unité d’absorbance à 260nm correspond à 100 microgramme/ml d’ADN double-brin
Faux, 50
Lorsque A260/A280 = ___ l’échantillon d’ADN est pure
Losque A260/A280 est ____ l’échantillon est contaminé
1.8
<1.8
Le fluoromètre Qubit est _____ à la spectrophotométrie
Complémentaire
Quels sont les avantages d’un fluoromètre?
ARN et ADN en même temps, + sensible, + spécifique, + précis
Vrai ou faux
Des méthodes universelle existe pour préparer de l’ADN cellulaire
Faux
Comment l’ADN cellulaire est préparer chez les organismes autres que les bactéries (3)?
- Briser en broyant le matériel gelé (azote liquide) dans un mortier
- Cell animales lysées avec un détergeant ou en utilisant du thiocyanate de guanidium
- Tissus végétaux méthode basée sur le détergeant CTAB
Pourquoi les méthodes de préparation d’extrait cellulaire diffèrent-elles chez les cellules animales et végétales?
Animales = dépourvues de paroi cellulaire
Végétales = riches en polysaccharides (difficile à éliminer
Quelles sont les 4 grandes classes d’enzymes utilisées pour manipuler de l’ADN (endonucléases de restriction)?
- Nucléase (endo, exo)
- Ligases
- Polymérase
- Enzymes de modification
Vrai ou faux
L’ADN doit être couper de manière très précise lors des manipulations de clonage
Vrai
Quel système spécialisé E. coli K12 possède-t-elle?
Système de restriction/modification
Chaque enzyme de restriction est associée avec une ____, formant un système de restriction/modification
Méthylase
Quel est le rôle des endonucléases de restriction chez E. coli K12?
Comment la cellule se protège-t-elle de ses enzymes?
Détruire l’ADN des organismes étrangers
À l’aide d’enzymes de modifications qui méthyles les A ou C à l’intérieur des séquences de reconnaissance des enddonucléases
Vrai ou faux
a) Les eucaryotes possède également des enzymes de restriction
b) Chaque enzymes de restriction est associé avec sa propre méthylase
c) Les enzymes/méthylases peuvent reconnaître différentes séquences
a) faux
b) vrai
c) faux, tjrs la même
Vrai ou faux
Les méthylases doivent méthylée les deux brins pour inhiber l’activité des enzymes de restriction
Faux, un seul 3’ ou 5’ ou les deux
Quels types d’enzymes sont les plus utilisées pour le clonage?
Types IIp
Comment sont classés les différents enzymes de restriction?
selon structure et propriété
Pourquoi les enzymes de type ___ sont les plus utilisés?
II, parce que les enzymes de type 1 et 3 forment des extrémités hétérogènes ce qui n’est pas utile pour le clonage
Que veut dire R dans EcoRI?
R = variété Ry13
Que veut dire d dand HindII?
d pour sérotype
Les enzymes de restriction de type II sont généralement composé de ….
Explique leur utilités
deux sous-unité identique
Responsable du clivage d’un des brins de la séquence de reconnaissance
Les enzymes de restriction génèrent des extrémités…
5’-phosphate et 3’-OH
Vrai ou faux
Les enzymes de restriction reconnaissent et coupent l’ADN à des séquences spécifiques
Vrai
Vrai ou faux
4000 endonucléases de restriction offrant un éventail de 400 spécificités de coupure différentes ont été découverte
Vrai
Vrai ou faux
Les séquences de reconnaissance répertoriées couvrent toutes les combinaisons de séquences possibles
Faux
Quelles sont les 3 types d’extrémités générés par les enzymes de restriction?
5’ overhang ends
blunt ends
3’ overhang ends
Qu’est ce qu’un isoschizomères?
enzymes de restriction reconnaissant la même séquence, mais provenant de différentes espèces bactériennes
Que font les isoschizomères imparfaits?
reconnaissent la même séquence, mais ne coupe pas entre les mêmes bases
Vrai ou faux
Certains isoschizomères sont influencés par le patron de méthylation
Vrai
Vrai ou faux
Deux endonucléase différentes ne peuvent produire des bouts collants identique
Faux, Des endonucléases qui ont des sites de reconnaissance et de clivage différents peuvent produire des bouts collants identiques
De quoi dépend le nombre et la taille moyenne des fragments obtenus suite au traitement à l’aide d’une enzyme de restriction?
- La complexité du génome
- La longueur de la séquence de reconnaissance
- La composition en bases du génome ou de l’ADN à digérer ainsi que de la séquence de reconnaissance
La composition en bases du génome ou de l’ADN étdier a une grande influence sur…
Le nombre de fragments générés par les enzymes de restriction
Sous quelle forme, quelle concentration et quelle durée sont disponible les enzymes de restriction?
solution glycérinée maintenue à -20, 10 U/uL, 1 année
Qu’est ce que U (quantité pour enzyme)
quantité d’enzyme requise pour digérer complètement 1ug d’ADN du phage A durant 1 heure
Vrai ou faux
Il est important de fournir les bonnes conditions de pH, température et force ionique
Vrai
Que pourrait amener des conditions incorrectes?
modifier la spécificité de l’enzyme (favorise l’activité star
Que contiennent les tampons de réactions?
À quoi servent-ils?
- Mg++
- Sel -> force ionique
- BSA -> stabiliser l’enzyme
- DTT -> agent réducteur
- Tampon -> maintenir le pH
Quel est le rôle des différentes composante de la solution d’arrêt?
- glycérol (50%) augmente densité -> précipitation au fond du puit
- SDS (0.5%) pour dénaturer l’enzyme et dissocier le complexe ADN/enzyme
- EDTA (50mM) pour chélater le Mg 2+
- Bleu de bromophénol (0.05%) pour suivre l’électrophorèse
L’électrophorèse se base sur quelle différence pour séparer les fragments?
Taille
Que permet le gel d’agarose contrairement au gel de polyacrylamide?
Séparer des molécules plus longues
Quelle est la relation entre la mobilité d’un fragment d’ADN et sa taille?
inversement proportionnelle au logarithme de sa taille
Quelle est la taille des fragments reconnus sur :
- Gel de polyacrylamide
- Gel d’agarose par méthode standard
- Gel d’agarose par méthode de champ alterné
- 1-1000 bases
- 0.5-25 kb
- 10-10 000 kb
Quelle est la différence entre la méthode standard et la méthode en champ alterné sur gel d’agarose?
alterné= direction du champ électrique est modifiée périodiquement
Vrai ou faux
La concentration de l’agarose ou de polyacrylamide change très peu la résolution des molécules d’ADN dans le gel
Faux
Quelle condition permet de résoudre des fragments qui diffèrent par un seul nucléotide sur gel de polyacrylamide?
Un gel très mince
Quel type de gel était utiliser pour séquencer manuellement l’ADN avec la technique de sanger?
gel très mince de polyacrylamide
Quelles sont les différentes méthode de visualisation des fragments pour l’électrophorèse?
Leurs avantages?
-EtBr et visualisation sous éclairage UV
Sensibilité : >1ng
Plus commune
-Fluorophore non-mutagène et visualisation sous UV ou visible
5x plus sensible que EtBr
visible = pas endommagé
-Autoradiographie
Très sensible
Comment fonctionne la visualisation au Bromure d’éthidium?
le bromure d’éthidium s’entercale entre les bases et l’intensité des bandes détectées est en fonction de la longueur des fragments
Vrai ou faux
l’ADN s’infiltre dans un gel d’agarose par ses extrémités et serpente à travers les pores du gel
Vrai
Vrai ou faux
La topologie des molécules d’ADN n’a pas d’influence sur leur mobilité dans un gel d’agarose
faux
Mettre les différentes topologies des molécules d’ADN en ordre croissant de leur mobilité dans un gel
Nicked ( circulaire avec cassure sb)
Linéare
superenroulement (plus compacte)
Quelle est la taille limite des molécules d’ADN pouvant être séparées par PFGE?
10 Mb
Vrai ou faux
a) Des génomes bactériens et tous les génomes d’eucaryotes unicellulaire peuvent être séparés par PFGE
b) Les chromosomes de plusieurs mammifères sont séparés par PFGE
a) Vrai
b) Faux, trop grand
Comment on prépare de l’ADN pour l’analyse par PFGE?
ADN pas en solution
Cellule intact avec agarose fondu -> forme un bloc
Incubé avec des enzymes pour digérer la paroi cellulaire
Vrai ou faux
Les blocs d’agarose pour l’analyse PFGE peuvent être traités avec presque tous les enzymes de restriction
Faux, Ceux qui coupent peu fréquemment
Vrai ou faux
a) Le bioanalyzer permet d’analyser en quelques minutes des échantillons d’acide nucléiques et de protéines par électrophorèse
b) Le bioanalyzer a une meilleure sensibilité que les systèmes traditionnels
c) Les quantités d’ADN doivent être supérieur à la normale pour les échantillons de bioanalyzer
a) Vrai
b) vrai
c) faux, quantité minimale ( 1uL)
De quoi sont remplis les micro-canaux pour une analyse par bioanalyzer?
d’un polymère et d’un colorant fluorescent
Quelle est la principale limitation du bioanalyzer?
taille maximale des fragments d’ADN = 12 kb
Pour quelle vérifications le bioanalyzer est-il très utile?
Pour vérifier si les fragments sont de la taille et concentration désirées ou s’il y a des contaminant
Quelle est la limite de taille d’un fragment d’ADN pour le femto pulse?
200kb
Que permettent les techniques de transfert southern et d’hybridation moléculaire?
identifier laquelle ou lesquelles des bandes dans un gel contiennent une séquence spécifique
Comment fonctionne un transfert southern?
- Transfert Southern. Les fragments d’ADN préalablement
résolus dans un gel d’agarose sont transférés sous forme
simple brin sur une membrane de nylon par capillarité.
Une fois l’électrophorèse terminée, le gel est placé dans
une solution alcaline (NaOH) pour dénaturer l’ADN, puis
un montage comme celui que l’on voit est effectué. - La membrane est hybridée avec une sonde radioactive
ou fluorescente qui contient une séquence spécifique
sous forme simple brin. Au cours de l’hybridation, la
sonde s’apparie avec l’ADN cible sur la membrane. Les
fragments qui se sont hybridés sont identifiés par
autoradiographie ou phosphorimaging.
Quelles étaient les applications de l’analyse southern (ère-pré-génomique)?
• Déterminer si un gène nouvellement identifié dans
un organisme est présent dans un autre organisme -> Maintenant PCR utilisé
• Déterminer précisément la position d’un gène
nouvellement cloné sur un génome ou molécule
d’ADN recombinante (une carte physique est un
pré-requis)
• Détecter des polymorphismes d’ADN
Quelle est la différence entre une analyse southern et une analyse northern?
Analyse northern = sonde hybridée avec une membrane contenant des ARNm séparés sur gel
Quelles sont les applications de l’analyse northern?
• Déterminer si une séquence d’ADN codant pour une protéine
potentielle est transcrite (exprimée au niveau de l’ARNm)
• Déterminer la taille de l’ARNm correspondant à un gène
d’intérêt
• Déterminer dans quels tissus ou stades du développement un
gène nouvellement identifié chez un eucaryote multicellulaire
est exprimé
Quelles sont les versions «moderne» des analyses southern et northern?
Les technologies de puces d’ADN (microarrays)
Qu’est ce qui est présent sur les sonde dans les microarrays?
ADNsb de séquence définie
Qu’est ce qui est contenus dans les supports solides portant les sondes?
oligos représentant des ORFs ou polymorphisme
Vrai ou faux
Les technologies de puces d’ADN ne permettent pas encore de travailler à l’échelle du génome global
Faux
Sur quels principes sont basés les technologies de puces d’ADN?
Quelles autres analyses utilisent le même principes?
hybridations en phase mixtes
Analyses southern et northern
Quelle est la différence entre les principes de southern et northern et les microarrays?
microarrays = sondes multiples et placées sur un petit support solide sous forme de grille
Sonde sont oligonucléotides
Peuvent représenter toutes les séquences d’un génome, seulement ORFs, ou encore des polymorphismes provenant de diverses régions
Comment fonctionne les microarrays?
Le support solide contenant les sondes est incubé en présence d’ADN
cellulaire total ou d’ADNc qui porte des marqueurs fluorescents. Après
l’hybridation, la puce est scannée avec un laser dont la lumière excite
les marqueurs fluorescents
Quelles sont les applications des microarrays?
• Génotypage de multiples régions génomiques afin
de détecter des polymorphismes (incluant SNP)
parmi les individus d’une population ou des
mutations
• Étude des changements d’expression des gènes
À quoi servait la cartographie physique dans l’ère pré-génomique?
préalable pour localiser les régions fonctionnelles sur l’ADN
Que montre une carte physique d’une molécule d’ADN?
l’emplacement des sites reconnus par plusieurs endonucléases de restriction.
Que faut-il déterminer pour construire une carte physique?
l’ordre des fragments de restriction dans la molécule d’ADN originale
Les cartes de restriction sont le plus souvent construites en…
digérant des molécules d’ADN recombinant dans lesquelles l’ADN d’intérêt a été cloné
Vrai ou faux
Le génome de E. coli a été cartographié en entier à partir d’une collection de molécules recombinantes après avoir été séquencé
Faux, avant d’avoir été séquencé
Pour quoi les cartes physiques sont utiles de nos jours?
Pour le clonage
Vrai ou faux
Les cartes physiques sont encore requises pour séquencer un génome
Faux
Les cartes physiques sont générer plus souvent :
a) par ordinateur
b) par méthode expérimentale
c) plus besoin de les générer
a
Nomme les deux méthodes expérimentales pour cartographier des molécules d’ADN de petites tailles?
- Digestion avec enzymes multiples (individuellement et en combinaison) et analyse par électrophorèse sur gel
- Digestion partielle d’une molécule d’ADN marquée à une seule extrémité
Quels sont les avantages/utilités et restriction de la méthode de digestion avec enzymes multiples?
Avantages : -plus rapide Restrictions : -petits segments d'ADN clonés -enzymes de restriction doivent couper peu fréquemment
nb d’enzyme de restriction ___ nb de digestion
=
Quelle est l’utilitée de la méthode de digestion partielle d’une molécule d’ADN marqué à une seule extrémité?
Utilisée dans les cas ou les enzymes de restriction coupe à plusieurs positions, ou pour cartographier des molécules relativement longue
Définir polymorphisme d’ADN
Variations de séquence entre les individus d’une même espèce (fréquence > 1%)
Explique les différents types de polymorphisme (SNP, RFLP, STR)
SNP = substitution d'une seule pb RFLP= SNP localisé dans la séquence de reconnaissance d'une enzyme de restriction STR= Variations du nombre de courtes répétitions en tandem
Environ combien de SNP sont présent dans le génome humain?
233 millions
Vrai ou faux
Chez l’humain, chaque groupe ethnique possède la même collection de SNP (universel)
Faux, chaque possède sa propre collection de SNP
Vrai ou faux
Les SNP sont le plus souvent retrouvé dans les région intragénique
Faux, intergénique
Les SNP peuvent aider à localiser…
Les gènes liés aux maladies
Comment sont détectés les SNP?
analyse par puces ADN, séquencage d’ADN, analyse de restriction pour les RFLP
Vrai ou faux
Les RFLP n’ont aucun effet sur les patrons de coupure de certaines enzymes de restriction
Faux, modifient certains patrons
Vrai ou faux
Les marqueurs RFLP de génomes complexes peuvent être mis en évidence par analyse southern?
Vrai
Vrai ou faux
Les polymorphismes suivent les lois de Mendel pour la transmission
Que cela impliquerait-il?
Vrai
Différents patrons d’hérédité sont observés lorsque les allèles de 2 gènes sont suivis
2 gènes sont liés lorsque le % de recombinaison est < 50%
Les marqueurs RLFP se comportent comme des ________ dans des croisements
Les marqueurs RLFP se comportent comme des marqueurs génétique dans des croisements
Vrai ou faux
Phénotypique et polymorphique sont liés ensembles
Vrai
Les ___ peuvent être associés à des gènes de maladies
SNP
Comment sont génotypés les polymorphismes dans les WGAS?
à l’aide de puces d’ADN
Qu’est ce que nous renseigne les GWAS?
sur les facteurs de risque associés aux maladies complexes
Un SNP est associé avec un trait particulier si sa fréquence est…
bcp plus élevée que prédit dans la cohorte possédant ce trait
odds ratio > 1 et P= 10^-7 ou 10^-8
Lesquels sont vrai
a) La plupart des SNP sont associés avec un faible risque (1.33)
b) la plupart des SNP n’ont presque aucun risque (0.2)
c) Très peu de SNP ont un odds ratio >3
d) Aucune SNP ont un odds ratio >3
e) bcp de SNP ont un odds ratio > 3
a,c
Vrai ou faux
La distance entre les marqueurs sur une carte génétique reflète nécessairement leur distance physique réelle
Faux
Quels analyses ont été effectuées pour déterminer lequel des 60 gènes potentiels dans une région de 600 kb est responsable du cancer du sein?
- Analyse southern en utilisant des ADN provenant de divers animaux
- Analyse northern en utilisant des ARNm provenant de divers tissus
- Séquencage des gènes potentiels provenant de patients et de personnes saines
- Knockout du gène chez la souris
Quelles sont les retombées importantes de l’analyse des polymorphismes dans le domaine biomédical?
• Identification des gènes de susceptibilité à des maladies
multifactorielles (diabète, cancer, obésité, maladies
psychiatriques)
• Dépistage de maladies et facteurs de risque par l’analyse de
polymorphismes spécifiques ou génomes entiers chez un individu
(médecine personnalisée)
• Développement de médicaments et thérapies spécifiques à des
génotypes (Pharmacogénomique et médecine personnalisée)
Les SNP influencent la réponse aux médicaments.
Quelles sont les retombées importantes de l’analyse des polymorphismes dans le domaine archaeogénétique?
- Étude de l’évolution humaine
* Migration des populations
Avec quoi sont réalisés les tests de génotypages?
puces de génotypages
Pour quoi sont utilisés les activités polymérase et exonucléase 3’->5’ de l’ADN polymérase du phage T4?
Pour marquer un fragment à ses deux extrémités
Vrai ou faux
Les ADN polymérases agissent toutes de la même manière
Faux
