Ch.1 enzyme utilisés comme outils pour manipuler l'ADN Flashcards
Qu’ont amenées les techniques d’analyses de gènes?
Révolution permettant l’analyse de gènes individuels, leur régulation et l’organisation de génomes complexes
Qu’a permis la PCR?
Des applications dans de nouveaux domaines
Séquencage d’ADN
Qu’est ce que le clonage de gènes?
Que requiert-il?
Processus d’amplification qui requiert d’abord l’union de gènes avec un vecteur, puis une cellule hôte de manière à amplifier la molécule recombinante
Qu’est ce que la PCR?
Quels sont ses avantages en terme de matériel?
Processus d’amplification in vitro
-Pas besoin de vecteur ni de cellules vivantes
Comment fonctionne a PCR?
Une région génomique précise est amplifiée de manière à générer des milliers de copies de cette région à partir de seulement quelques molécules d’ADN
Pourquoi le clonage de gènes et la PCR sont importants?
- Produisent des échantillons purs de gène individuel
- Permettent l’étude de la structure des gènes
- Clonage permet la purification de ce fragment
- Chaque clone possède de multiples copies d’une seule molécules
Vrai ou faux
L’ensemble des clones obtenus contiennent de nombreuses molécules recombinante différentes
Vrai
Quel est l’avantage de la PCR par rapport au clonage?
Permet d’amplifier sélectivement et rapidement le gène désiré
Quelles sont les limitations de la PCR?
Les séquences de chaque coté du gène doivent être connues
La longueur de l’ADN pouvant être amplifier est limité
Vrai ou faux
Une fois isolé un gène est souvent inséré dans un vecteur spécialisé
Vrai
Quelles sont les étapes pour purifier de l’ADN cellulaire total?
- Une culture bactérienne est «grown» et «harvested»
- Les cellules sont enlevés et détruite pour avoir un extrait cellulaire
- L’ADN est purifier
- L’ADN est concentrer
Que veut dire «ADN pure»?
Non contaminé par des protéines et des polysaccharides et non dégradé
Comment peut on savoir que l’ADN n’est pas pure?
Poids moléculaire plus élevé
Quelles sont les différentes méthodes utilisées pour préparer un extrait cellulaire?
Donne un example pour chaque
L’ADN reste-t-il intact avec une de ces méthodes?
Physiques ou chimiques
P= écraser C= agents chimiques
Non
Quelle méthode est utilisée pour faire un extrait cellulaire chez E. coli?
Lysozyme en présence de EDTA pour briser la paroi cellulaire et du SDS pour la membrane
Quels sont les deux rôles du EDTA dans la préparation d’un extrait cellulaire?
- Affaiblir la paroi
2. Inhiber l’activité des enzymes intracellulaires dégradant l’ADN
Quels sont les rôles du SDS dans la préparation d’un extrait cellulaire?
- Dissocier les protéines membranaires
2. Inhiber l’activité des enzymes cellulaires
Quels sont les deux approches pour purifier de l’ADN à partir d’un extrait cellulaire?
a) Dégradation des contaminants par extraction avec phénol ou phénol : chloroforme (1:1) et digestion enzymatique
b) Séparation de l’ADN des contaminants par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions ou thiocyanate de guanidium et silice
Quels sont les deux enzymes utilisés dans la purification de l’ADN par dégradation des contaminants?
Protéase et ribonucléase
Vrai ou faux
Le phénol avec du chloroforme amène à une moins bonne séparation de la phase aqueuse et de la phase organique
Faux, meilleure
Quel est l’effet du phénol dans la purification de l’ADN?
Est-ce qu’un autre composé est ajouté par la suite?
Dénature protéine
Oui, RNase pure
Expliquer la purification de l’ADN par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions
Les molécules chargés négativement (ADN, ARN, certaines prots) se lient à la résine chargée positivement. Elles se détachent en présence de sels
Dépose l’extrait cellulaire sur la colonne puis on fait passer successivement 2 solutions de sels. 2eme plus concentrer = ADN, premiere = reste.
Éluat récolté par gravité ou centrifugation
Expliquer la purification de l’ADN par la méthode de thiocyanate de guanidium et silice
L’extrait cellulaire + thiocyanate de guanidium est déposé sur une colonne de silice, ADN colle à silice. Reste est enlever. Récupère l’ADN avec eau
Le thiocyanate de guanidium est aussi utilisé pour ____, parce qu’il laisse____
dénaturer prots, entrer l’eau dans les molécules
Quel est l’avantage principal d’utiliser la méthode de thiocyanate de guanidium et silice?
Peut être automatisé = traiter de nombreux échantillons à la fois
Comment les échantillons d’ADN sont-ils concentrés?
Par précipitation avec de l’éthanol
à -20 degré C en présence d’ions Na+ et 2 à 2.5 volumes d’éthanol 95%
C élevé = tige de verre
Dilué = centrifugation
Comment détermine-t-on la concentration et la pureté de l’ADN purifié?
Par mesure de l’absorbance à 260 et 280 nm en utilisant nanodrop
Vrai ou faux
Une unité d’absorbance à 260nm correspond à 100 microgramme/ml d’ADN double-brin
Faux, 50
Lorsque A260/A280 = ___ l’échantillon d’ADN est pure
Losque A260/A280 est ____ l’échantillon est contaminé
1.8
<1.8
Le fluoromètre Qubit est _____ à la spectrophotométrie
Complémentaire
Quels sont les avantages d’un fluoromètre?
ARN et ADN en même temps, + sensible, + spécifique, + précis
Vrai ou faux
Des méthodes universelle existe pour préparer de l’ADN cellulaire
Faux
Comment l’ADN cellulaire est préparer chez les organismes autres que les bactéries (3)?
- Briser en broyant le matériel gelé (azote liquide) dans un mortier
- Cell animales lysées avec un détergeant ou en utilisant du thiocyanate de guanidium
- Tissus végétaux méthode basée sur le détergeant CTAB
Pourquoi les méthodes de préparation d’extrait cellulaire diffèrent-elles chez les cellules animales et végétales?
Animales = dépourvues de paroi cellulaire
Végétales = riches en polysaccharides (difficile à éliminer
Quelles sont les 4 grandes classes d’enzymes utilisées pour manipuler de l’ADN (endonucléases de restriction)?
- Nucléase (endo, exo)
- Ligases
- Polymérase
- Enzymes de modification
Vrai ou faux
L’ADN doit être couper de manière très précise lors des manipulations de clonage
Vrai
Quel système spécialisé E. coli K12 possède-t-elle?
Système de restriction/modification
Chaque enzyme de restriction est associée avec une ____, formant un système de restriction/modification
Méthylase
Quel est le rôle des endonucléases de restriction chez E. coli K12?
Comment la cellule se protège-t-elle de ses enzymes?
Détruire l’ADN des organismes étrangers
À l’aide d’enzymes de modifications qui méthyles les A ou C à l’intérieur des séquences de reconnaissance des enddonucléases
Vrai ou faux
a) Les eucaryotes possède également des enzymes de restriction
b) Chaque enzymes de restriction est associé avec sa propre méthylase
c) Les enzymes/méthylases peuvent reconnaître différentes séquences
a) faux
b) vrai
c) faux, tjrs la même
Vrai ou faux
Les méthylases doivent méthylée les deux brins pour inhiber l’activité des enzymes de restriction
Faux, un seul 3’ ou 5’ ou les deux
Quels types d’enzymes sont les plus utilisées pour le clonage?
Types IIp
Comment sont classés les différents enzymes de restriction?
selon structure et propriété
Pourquoi les enzymes de type ___ sont les plus utilisés?
II, parce que les enzymes de type 1 et 3 forment des extrémités hétérogènes ce qui n’est pas utile pour le clonage
Que veut dire R dans EcoRI?
R = variété Ry13
Que veut dire d dand HindII?
d pour sérotype
Les enzymes de restriction de type II sont généralement composé de ….
Explique leur utilités
deux sous-unité identique
Responsable du clivage d’un des brins de la séquence de reconnaissance
Les enzymes de restriction génèrent des extrémités…
5’-phosphate et 3’-OH
Vrai ou faux
Les enzymes de restriction reconnaissent et coupent l’ADN à des séquences spécifiques
Vrai
Vrai ou faux
4000 endonucléases de restriction offrant un éventail de 400 spécificités de coupure différentes ont été découverte
Vrai
Vrai ou faux
Les séquences de reconnaissance répertoriées couvrent toutes les combinaisons de séquences possibles
Faux
Quelles sont les 3 types d’extrémités générés par les enzymes de restriction?
5’ overhang ends
blunt ends
3’ overhang ends
Qu’est ce qu’un isoschizomères?
enzymes de restriction reconnaissant la même séquence, mais provenant de différentes espèces bactériennes
Que font les isoschizomères imparfaits?
reconnaissent la même séquence, mais ne coupe pas entre les mêmes bases