Ch.4 Vecteurs pour le clonage chez E. coli Flashcards
Sur quoi est dicté le choix du vecteur de clonage?
Sur la longueur d’insertion et le but poursuivi
Quels éléments sont présents dans tous les vecteurs de clonage?
- Réplicon
- Marqueur(s) pour sélectionner le vecteur
- Site(s) de clonage
- Marqueur pour sélectionner les molécules recombinantes
Les plasmides sont des molécules d’ADN circulaires qui se propagent…
indépendamment du chromosome bactérien
Quel était le premier vecteur de clonage d’utilisation générale?
pBR322
Les séquences de pBR322 proviennent de ___ plasmides naturels de ____
3, E.coli
pBR322 se réplique de manière ____ à partir de l’extrémité ___ d’une amorce d’ARN
unidirectionnelle, 3’
Vrai ou faux
Les cellules compétentes sont produites par méthodes physique
Faux, traitement chimique
Vrai ou faux
La transformation de cellules compétentes est la méthode la plus efficace
Faux, méthode inefficace
Pourquoi doit-on utiliser un marqueur de sélection pour identifier les transformants?
• Avec 1 ng de pBR322, on produit 1,000-
10,000 transformants, ce qui correspond à
l’entrée de seulement 0.01% des molécules
d’ADN disponibles
• Les transformants obtenus ne représentent
donc qu’une très petite fraction des cellules
compétentes
• Cʼest pour cette raison quʼil faut utiliser un
marqueur de sélection pour identifier les
transformants
Vrai ou faux
Les antibiotiques sont souvent utilisés pour sélectionner les cellules compétentes qui ont acquis un plasmide
Vrai
Quelles sont les marqueurs de sélection utilisé avec la plasmide pBR322?
ampiciline ou tétracycline
Que doit-on faire avant de mettre les cellule sur une gélose contenant un milieu sélectif?
Pourquoi?
Avant de les étaler sur gélose contenant un antibiotique, les
transformants doivent être maintenus sur milieu non sélectif
durant une courte période pour permettre lʼexpression de
lʼenzyme de résistance aux antibiotiques
Qu’est ce que l’électroporation?
Lʼélectroporation utilise une pulsation électrique pour induire des pores microscopiques dans les membranes de E. coli, permettant ainsi la transformation des cellules bactériennes avec des plasmides ou autre types de vecteurs
La sélection des
transformants portant des
plasmides pBR322
recombinants tire profit de…
lʼinactivation insertionnelle
de gènes de résistance aux
antibiotiques
Les plasmides de la série pUC ont été développés au cours des années 1980 pour…
permettre l’identification plus rapide des transformants portant des plasmides recombinants
Quelle activité est rétablie par l’expression du peptide ___ codé par le gène lacZ’ des plasmides pUC?
a
activité b-galactosidase du peptide oméga codéé par le génome de la cellule hote de E. coli
Que permet l’inactivation insertionnelle du gène lacZ’?
ʼ permet
lʼidentification directe des transformants portant des
plasmides pUC recombinants sur gélose contenant du
Xgal, de lʼIPTG et de lʼampicilline
Vrai ou faux
deux plasmides utilisant le même système de réplication peuvent coexister de manière stable chez E. coli
Explique
Faux,
compétition
des plasmides durant la réplication et l’étape
ultérieure de ségrégation aux cellules-filles
Pourquoi les plasmides pACYC177 sont compatibles avec les plasmides de types pMB1?
Parce qu’ils sont basés sur le réplicon P15A
Ou se retrouve l’ADN dans la méthode de purification d’ADN par centrifugation dans des gradients de CsCl?
plus ou moins au milieu (1.70 selon contenu G/C)
Protéines au dessus
ARN en dessous
Vrai ou faux
Un plus grand nombre de molécules d’EtBr s’intercalent dans l’ADN circulaire que dans l’ADN linéaire
Faux, contraire
Que permet la fixation différentielle d’EtBr?
Permet de purifier l’ADN cicrulaire superenroulé dans des gradients de CsCl saturé d’EtBr
Quelle méthode est utilisée par les trousse commerciale de purification d’ADN plasmidique?
Chromatographie sur bille de silice avec thiocyanate de guanidium
En présence de quel composé le nombre de copies de plasmide d’E. coli peut être amplifier?
Chloramphénicol
Décrire le cycle lytique du bactériophage lambda
- Phage s’attache à la bactérie et injecte son ADN
- La molécule d’ADN du phage est répliquée
- Les composantes de la capside sont synthétisées les composantes sont assemblée et relachée
- Lyse de la cellule
Vrai ou faux
La tête et la queue du phage lambda sont synthétiser et assemblée comme une composante
Faux, assemblée séparement
Comment sont cultivés les phages lambda?
Cultivés par étalement des particules sur un tapis bactérien
À quels sites l’ADN concatémérique du phage lambda est clivé lors de l’encapsidation
Sites cos
Quelles longueurs doit avoir l’ADN lors de l’encapsidation in vitro pour que le phage soit viable?
ADN entre 2 sites cos
Au moins 38 kpb
Au plus 52 kpb
Comment ont été créer les vecteurs lambda d’insertion?
Par élimination des régions non-essentielles de lambda sauvage
Vrai ou faux
Plus le vecteur est gros plus sa capacité de clonage est élevée
Faux, contraire
Ou est insérer l’ADN lors de la fabrication de vecteurs d’insertion de lambda?
Dans ses sites de restriction uniques servant au clonage
Les vecteurs lambda de _______ permettent de cloner de plus grands fragments d’ADN
Pour quoi ces vecteurs servent-ils?
remplacement
Pour banque d’ADN génomique
Que remplace l’ADN dans les vecteurs lambda de remplacement?
un segment d’ADN du vecteur contenant des séquences non essentielles à la prolifération du phage (stuffer DNA)
Vrai ou faux
La stratégie générale de clonage dans un vecteur lambda de remplacement est une méthodologie extrêmement efficace
Vrai
Quelle est La stratégie générale de clonage dans un vecteur lambda de remplacement?
- ADN du vecteur est clivé avec les enzymes de restriction
- appariement des bras de lambda et enlevement des «stuffer fragments» par méthodes physiques
- Ligature des bras de lambda au fragments d’ADN voulus
- Empactage in vitro des molécules d’ADN concatémaire
- Infection de E. coli
Quelles sont les deux méthodes pour minimiser la formation de phages parentaux dans des expériences de clonage avec les vecteurs d’insertion?
Expliquer les méthodes
- Déphosphorylation du vecteur
Les extrémités
collantes du vecteur (sites cos) sont d’abord
associées, le vecteur est digéré avec l’enzyme ou
les enzymes de restriction appropriées, et
finalement les extrémités 5ʼ sont déphosphorylées - Digestion du vecteur avec deux endonucléases de restriction produisant des bouts incompatibles
- Clonage directionnel de l’ADNc
- Seulement pour clonage multiple
- Une seule orientation
Quelles sont les trois méthodes pour minimiser la formation de phages parentaux dans des expériences de clonage avec les vecteurs de remplacement?
Expliquer les méthodes
Quelle est la meilleure?
- Séparation du fragment ʻstufferʼ des bras du vecteur par
centrifugation dans un gradient de sucrose ou par
électrophorèse sur gel d’agarose - Digestion du vecteur avec deux endonucléases de
restriction afin de générer des bouts non complémentaires
entre le ʻstufferʼ et les bras. Par exemple, on digère EMBL4
avec BamHI et EcoRI et on précipite les grands fragments
obtenus avec de l’isopropanol. Dans ces conditions, les
oligonucléotides compris entre ces deux sites de restriction
ne précipitent pas - Remplissage partiel dʼextrémités 5ʼ protubérantes -> meilleure
Quelles sont les méthodes de sélection des phages recombinants?
Quelles méthodes s’applique uniquement pour les vecteurs de remplacement?
- Inactivation insertionnelle du gène cl de lambda (sélection hfl-)
- Inactivation insertionnelle du gène lacZ ou lacZ’
- Sélection du phénotype Spi
- Sélection par taille
3 et 4
Comment sont séparer les phages des bactéries non lysées et des débris cellulaires?
Par centrifugation, suivit d’une précipitationdu surnageant par centrifugation en présence de PEG
Vrai ou faux
Les particules de bactériophages peuvent être purifier par centrifugation dans des gradients de CsCl
Vrai
Vrai ou faux
Les cosmides recombinants sont sélectionnés lors de l’étape d’infection
Faux, d’encapsidation
Que contient les vecteurs PAC?
Les vecteurs PAC contiennent les réplicons plasmidiques et lytiques du bactériophage P1 de même qu’un site de clivage pac permettant l’encapsidation de l’ADN dans des particules de phages
Comment la nucléase de PAC coupe l’ADN?
Elle coupe lorsque la tête est pleine
Vrai ou faux le vecteur PAC ressemble à lambda, mais plus petit
Faux, plus gros
Par quoi est catalysée le mécanisme de recombinaison spécifique dans les vecteurs PAC?
par la recombinase Cre de P1
Que sont les vecteurs BAC?
Versions modifiées de l’épisome de E. coli (plasmide F’)
Que permet le vecteur M13 de différent des autres?
permet de séquencer de l’ADNsb
Nomme une caractéristique du plasmide du vecteur M13
Presque pas de séquences intergéniques
vrai ou faux
Le cycle de vie du phage M13 comprend un cycle lytique
Faux
Comment les phage M13 se propage dans une colonie de E. coli?
phage filamenteux -> propagation et excrétion
Le phage M13 nécessite une cellule ___ de E.coli
Mâle
Le phage M13 infecte à… (endroit d’infection)
À l’extrémité des poils
Vrai ou faux
Le phage M13 peut insérer moins de pb que le phage lambda
Faux, plus (4000)
Que permet la présence d’une origine de réplication f1, fd ou M13 dans un phagemide?
La production de pseudo-particules de pahge contenant de l’ADNsb
Quel vecteur de la levure permet le clonage de très grand fragments d’ADN?
YAC
Quels sont les inconvénients que présentent certains gènes d’E.coli k12 pour le clonage?
- L’ADN recombinant introduit dans cette souche sera dégradé par EcoK1
- Étant méthylé aux sites Dam et donc, il ne pourra être coupé par certaines enzymes de restriction et être introduit dans un vecteur dam-.
- L’ADN d’eucaryotes supérieurs contenant des îlots CpG méthylés ne pourra être cloné sous forme de longs fragments -> dégradé par système de restriction mcr et mrr
Quelle est la souche d’E.coli idéale pour le clonage?
delta mcrBC-, hsdRMS-, mrr-,dam-, dcm-, recA-
Quels sont les inconvénients que représente le gène recA pour le clonage?
activité recA cause des délétions lorsqu’il y a recombinaison entre éléments répétés en direct
l’activité recA peut causer des réarrangements lorsqu’il y a recombinaison entre séquences répétées et inversées
