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ADN recombinant > Ch.4 Vecteurs pour le clonage chez E. coli > Flashcards

Ch.4 Vecteurs pour le clonage chez E. coli Flashcards

1
Q

Sur quoi est dicté le choix du vecteur de clonage?

A

Sur la longueur d’insertion et le but poursuivi

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Q

Quels éléments sont présents dans tous les vecteurs de clonage?

A
  • Réplicon
  • Marqueur(s) pour sélectionner le vecteur
  • Site(s) de clonage
  • Marqueur pour sélectionner les molécules recombinantes
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3
Q

Les plasmides sont des molécules d’ADN circulaires qui se propagent…

A

indépendamment du chromosome bactérien

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4
Q

Quel était le premier vecteur de clonage d’utilisation générale?

A

pBR322

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5
Q

Les séquences de pBR322 proviennent de ___ plasmides naturels de ____

A

3, E.coli

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6
Q

pBR322 se réplique de manière ____ à partir de l’extrémité ___ d’une amorce d’ARN

A

unidirectionnelle, 3’

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7
Q

Vrai ou faux

Les cellules compétentes sont produites par méthodes physique

A

Faux, traitement chimique

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8
Q

Vrai ou faux

La transformation de cellules compétentes est la méthode la plus efficace

A

Faux, méthode inefficace

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9
Q

Pourquoi doit-on utiliser un marqueur de sélection pour identifier les transformants?

A

• Avec 1 ng de pBR322, on produit 1,000-
10,000 transformants, ce qui correspond à
l’entrée de seulement 0.01% des molécules
d’ADN disponibles
• Les transformants obtenus ne représentent
donc qu’une très petite fraction des cellules
compétentes
• Cʼest pour cette raison quʼil faut utiliser un
marqueur de sélection pour identifier les
transformants

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10
Q

Vrai ou faux

Les antibiotiques sont souvent utilisés pour sélectionner les cellules compétentes qui ont acquis un plasmide

A

Vrai

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11
Q

Quelles sont les marqueurs de sélection utilisé avec la plasmide pBR322?

A

ampiciline ou tétracycline

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12
Q

Que doit-on faire avant de mettre les cellule sur une gélose contenant un milieu sélectif?
Pourquoi?

A

Avant de les étaler sur gélose contenant un antibiotique, les
transformants doivent être maintenus sur milieu non sélectif
durant une courte période pour permettre lʼexpression de
lʼenzyme de résistance aux antibiotiques

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13
Q

Qu’est ce que l’électroporation?

A 
Lʼélectroporation utilise 
une pulsation électrique 
pour induire des pores 
microscopiques dans les 
membranes de E. coli, 
permettant ainsi la 
transformation des cellules 
bactériennes avec des 
plasmides ou autre types 
de vecteurs
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14
Q

La sélection des
transformants portant des
plasmides pBR322
recombinants tire profit de…

A

lʼinactivation insertionnelle
de gènes de résistance aux
antibiotiques

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15
Q

Les plasmides de la série pUC ont été développés au cours des années 1980 pour…

A

permettre l’identification plus rapide des transformants portant des plasmides recombinants

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16
Q

Quelle activité est rétablie par l’expression du peptide ___ codé par le gène lacZ’ des plasmides pUC?

A

a

activité b-galactosidase du peptide oméga codéé par le génome de la cellule hote de E. coli

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17
Q

Que permet l’inactivation insertionnelle du gène lacZ’?

A

ʼ permet
lʼidentification directe des transformants portant des
plasmides pUC recombinants sur gélose contenant du
Xgal, de lʼIPTG et de lʼampicilline

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18
Q

Vrai ou faux

deux plasmides utilisant le même système de réplication peuvent coexister de manière stable chez E. coli

Explique

A

Faux,

compétition
des plasmides durant la réplication et l’étape
ultérieure de ségrégation aux cellules-filles

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19
Q

Pourquoi les plasmides pACYC177 sont compatibles avec les plasmides de types pMB1?

A

Parce qu’ils sont basés sur le réplicon P15A

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20
Q

Ou se retrouve l’ADN dans la méthode de purification d’ADN par centrifugation dans des gradients de CsCl?

A

plus ou moins au milieu (1.70 selon contenu G/C)

Protéines au dessus

ARN en dessous

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21
Q

Vrai ou faux

Un plus grand nombre de molécules d’EtBr s’intercalent dans l’ADN circulaire que dans l’ADN linéaire

A

Faux, contraire

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22
Q

Que permet la fixation différentielle d’EtBr?

A

Permet de purifier l’ADN cicrulaire superenroulé dans des gradients de CsCl saturé d’EtBr

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23
Q

Quelle méthode est utilisée par les trousse commerciale de purification d’ADN plasmidique?

A

Chromatographie sur bille de silice avec thiocyanate de guanidium

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24
Q

En présence de quel composé le nombre de copies de plasmide d’E. coli peut être amplifier?

A

Chloramphénicol

25
Q

Décrire le cycle lytique du bactériophage lambda

A
  1. Phage s’attache à la bactérie et injecte son ADN
  2. La molécule d’ADN du phage est répliquée
  3. Les composantes de la capside sont synthétisées les composantes sont assemblée et relachée
  4. Lyse de la cellule
26
Q

Vrai ou faux

La tête et la queue du phage lambda sont synthétiser et assemblée comme une composante

A

Faux, assemblée séparement

27
Q

Comment sont cultivés les phages lambda?

A

Cultivés par étalement des particules sur un tapis bactérien

28
Q

À quels sites l’ADN concatémérique du phage lambda est clivé lors de l’encapsidation

A

Sites cos

29
Q

Quelles longueurs doit avoir l’ADN lors de l’encapsidation in vitro pour que le phage soit viable?
ADN entre 2 sites cos

A

Au moins 38 kpb

Au plus 52 kpb

30
Q

Comment ont été créer les vecteurs lambda d’insertion?

A

Par élimination des régions non-essentielles de lambda sauvage

31
Q

Vrai ou faux

Plus le vecteur est gros plus sa capacité de clonage est élevée

A

Faux, contraire

32
Q

Ou est insérer l’ADN lors de la fabrication de vecteurs d’insertion de lambda?

A

Dans ses sites de restriction uniques servant au clonage

33
Q

Les vecteurs lambda de _______ permettent de cloner de plus grands fragments d’ADN

Pour quoi ces vecteurs servent-ils?

A

remplacement

Pour banque d’ADN génomique

34
Q

Que remplace l’ADN dans les vecteurs lambda de remplacement?

A

un segment d’ADN du vecteur contenant des séquences non essentielles à la prolifération du phage (stuffer DNA)

35
Q

Vrai ou faux

La stratégie générale de clonage dans un vecteur lambda de remplacement est une méthodologie extrêmement efficace

A

Vrai

36
Q

Quelle est La stratégie générale de clonage dans un vecteur lambda de remplacement?

A
  1. ADN du vecteur est clivé avec les enzymes de restriction
  2. appariement des bras de lambda et enlevement des «stuffer fragments» par méthodes physiques
  3. Ligature des bras de lambda au fragments d’ADN voulus
  4. Empactage in vitro des molécules d’ADN concatémaire
  5. Infection de E. coli
37
Q

Quelles sont les deux méthodes pour minimiser la formation de phages parentaux dans des expériences de clonage avec les vecteurs d’insertion?

Expliquer les méthodes

A
  1. Déphosphorylation du vecteur
    Les extrémités
    collantes du vecteur (sites cos) sont d’abord
    associées, le vecteur est digéré avec l’enzyme ou
    les enzymes de restriction appropriées, et
    finalement les extrémités 5ʼ sont déphosphorylées
  2. Digestion du vecteur avec deux endonucléases de restriction produisant des bouts incompatibles
    - Clonage directionnel de l’ADNc
    - Seulement pour clonage multiple
    - Une seule orientation
38
Q

Quelles sont les trois méthodes pour minimiser la formation de phages parentaux dans des expériences de clonage avec les vecteurs de remplacement?

Expliquer les méthodes
Quelle est la meilleure?

A
  1. Séparation du fragment ʻstufferʼ des bras du vecteur par
    centrifugation dans un gradient de sucrose ou par
    électrophorèse sur gel d’agarose
  2. Digestion du vecteur avec deux endonucléases de
    restriction afin de générer des bouts non complémentaires
    entre le ʻstufferʼ et les bras. Par exemple, on digère EMBL4
    avec BamHI et EcoRI et on précipite les grands fragments
    obtenus avec de l’isopropanol. Dans ces conditions, les
    oligonucléotides compris entre ces deux sites de restriction
    ne précipitent pas
  3. Remplissage partiel dʼextrémités 5ʼ protubérantes -> meilleure
39
Q

Quelles sont les méthodes de sélection des phages recombinants?
Quelles méthodes s’applique uniquement pour les vecteurs de remplacement?

A
  1. Inactivation insertionnelle du gène cl de lambda (sélection hfl-)
  2. Inactivation insertionnelle du gène lacZ ou lacZ’
  3. Sélection du phénotype Spi
  4. Sélection par taille

3 et 4

40
Q

Comment sont séparer les phages des bactéries non lysées et des débris cellulaires?

A

Par centrifugation, suivit d’une précipitationdu surnageant par centrifugation en présence de PEG

41
Q

Vrai ou faux

Les particules de bactériophages peuvent être purifier par centrifugation dans des gradients de CsCl

A

Vrai

42
Q

Vrai ou faux

Les cosmides recombinants sont sélectionnés lors de l’étape d’infection

A

Faux, d’encapsidation

43
Q

Que contient les vecteurs PAC?

A 
Les vecteurs PAC 
contiennent les réplicons 
plasmidiques et lytiques du 
bactériophage P1 de même 
qu’un site de clivage pac
permettant l’encapsidation 
de l’ADN dans des 
particules de phages
44
Q

Comment la nucléase de PAC coupe l’ADN?

A

Elle coupe lorsque la tête est pleine

45
Q

Vrai ou faux le vecteur PAC ressemble à lambda, mais plus petit

A

Faux, plus gros

46
Q

Par quoi est catalysée le mécanisme de recombinaison spécifique dans les vecteurs PAC?

A

par la recombinase Cre de P1

47
Q

Que sont les vecteurs BAC?

A

Versions modifiées de l’épisome de E. coli (plasmide F’)

48
Q

Que permet le vecteur M13 de différent des autres?

A

permet de séquencer de l’ADNsb

49
Q

Nomme une caractéristique du plasmide du vecteur M13

A

Presque pas de séquences intergéniques

50
Q

vrai ou faux

Le cycle de vie du phage M13 comprend un cycle lytique

A

Faux

51
Q

Comment les phage M13 se propage dans une colonie de E. coli?

A

phage filamenteux -> propagation et excrétion

52
Q

Le phage M13 nécessite une cellule ___ de E.coli

A

Mâle

53
Q

Le phage M13 infecte à… (endroit d’infection)

A

À l’extrémité des poils

54
Q

Vrai ou faux

Le phage M13 peut insérer moins de pb que le phage lambda

A

Faux, plus (4000)

55
Q

Que permet la présence d’une origine de réplication f1, fd ou M13 dans un phagemide?

A

La production de pseudo-particules de pahge contenant de l’ADNsb

56
Q

Quel vecteur de la levure permet le clonage de très grand fragments d’ADN?

A

YAC

57
Q

Quels sont les inconvénients que présentent certains gènes d’E.coli k12 pour le clonage?

A
  1. L’ADN recombinant introduit dans cette souche sera dégradé par EcoK1
  2. Étant méthylé aux sites Dam et donc, il ne pourra être coupé par certaines enzymes de restriction et être introduit dans un vecteur dam-.
  3. L’ADN d’eucaryotes supérieurs contenant des îlots CpG méthylés ne pourra être cloné sous forme de longs fragments -> dégradé par système de restriction mcr et mrr
58
Q

Quelle est la souche d’E.coli idéale pour le clonage?

A

delta mcrBC-, hsdRMS-, mrr-,dam-, dcm-, recA-

59
Q

Quels sont les inconvénients que représente le gène recA pour le clonage?

A

activité recA cause des délétions lorsqu’il y a recombinaison entre éléments répétés en direct

l’activité recA peut causer des réarrangements lorsqu’il y a recombinaison entre séquences répétées et inversées

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