Sekvensering Flashcards
hva er et annet ord for sanger sekvensering?
Dideoksy-sekvensering
hva skjer under sanger sekvensering?
Dideoksy-sekvensering (Sanger-sekvensering) gir kjede terminering under polymerisering og fragmenter av ulik størrelse
hva skjer med en dna kjede om man tilsetter en dideoxyribonucleosid istedenfor et vanlig nukleosid?
blanding av små mengder dideoksy-nuklotider gir kjede terminering under polymerisering og fragmenter av ulik størrelse, det vil si at tilsettingen av dideoksy-nuklotider hindrer videre dannelse av dna kjeden
hvordan kan man finne ut hele sekvensen fra en dna tråd?
aller først vil dna tråden bli hybridisert med en liten primer. Dna vil så blandes med dna polymerase, overskudd av nukleotider og en liten mengde av de 4 diodeoxy nukleotidene som alle har en fluoriserende forbindelse koblet til seg. siden diodeoxy aktiveres tilfeldig vil vær reaksjon føre til en ny dna kjede som terminerer en ny punkt i dna tråden. reaksjonsproduktene blir lagt på en lang tynn kapillær gel som blir separert ved elektroforese. en kamera leser fargene på hvert bånd og sender informasjonen til en datamaskin samler sammen sekvensene. sekvensene som ble lest fra gelen vil nå være komplementære med sekvensene i det originale dna molekylet
forklar hvordan illumina sekvensering fungerer
et genom blir delt inn i flere små biter. fragmentene blir så tilsatt adaptorer som fester seg på komplementære områder i en flow celle. deretter blir det gjennomført PCR for å danne DNA clusters (områder med dna molekyler) som hver inneholder 1000 kopier av et enkelt dna fragment. det store antallet av clusters gir en komplett oversikt av genomet. i det første trinnet vil dna clusterne inkuberes med dna polymerase og et spesielt sett med 4 nukleosidisk trifosfatase. disse har fått to reversible modifikasjoner: en fluoriserende markør og en 3 kjemisk gruppe (dideoxy nukleotider) som terminerer dna syntesen. etter at en nukleotid blir tilført blir det tatt et bildet av dna clusterne og hvilke fluorescerende farge de for. i det andre trinne vil dna trådene bli kjemisk behandlet for å fjerne den fluoriserende markøren og 3 kjemisk gruppe (dideoxy nukleotider) en ny gruppe med fluoriserende materiale og terminator molekyler blir tilført for å starte en ny dna syntese. disse trinnene blir repetert til dna sekvensen blir helt ferdig. bildene som ble tatt på hver dna syntese blir samlet sammen for å danne en oversikt over hele genomets sekvens.
hvorfor bruker man en referansesekvens ?
Sammenligner prøven med referanse sekvens for å se hva som er galt
hva er reads? hvordan påvirker dette testen?
reads er det samme som rådata fra sekvenseringen av prøven, jo mer reads man har jo mer nøyaktig blir testen
hva bruker man Eksom og eller hel-genomsekvensering til?
• Eksom-sekvensering brukes for å bestemme DNA-sekvens i den
proteinkodende delen av DNA (1-2 % av genomet)
- Hel-genomsekvensering brukes for å identifisere:
- Strukturelle endringer
- Endringer i kontrollregioner
- Endringer i spleiseseter
hvilke informajson kan man få ut fra Transkriptomsekvensering?
Transkriptomsekvensering gir absolutt informasjon om mRNA-mengden i prøven
hvorfor sammenligner man ulike genomanalyser?
Ved å sammenlikne ulike genomanalyser kan man identifisere
gener og forutsi noe om deres funksjon
hva kan sekvensering brukes til?
- Sekvensering kan brukes til å forstå biologiske prosesser
- Hvordan er genomet organisert?
- Hva blir transkribert og hvor transkribsjonsfaktorer binder seg?
- Hvor binder proteiner seg?
- Hva er methylert?
- Hva har blitt mutert etc?
- Finne forskjell på metastaserende svulster og ikke metastaserende svulster
- Finne funksjonen til ikke kodende RNA
- Med andre ord: Hvordan virker det?
