PCR konvensjonell Flashcards
Hva bruker man PCR til?
• Påvisning av gener/forandring av gener knyttet til
bestemte sykdommer (diagnostikk)
• Påvisning av mikroorganismer (diagnostikk)
(eks påvisning av EBV)
• Identifikasjon av personer og legemsdeler
(rettsmedisin)
• Undersøkelse av slektskap
• Farmakogenetikk
• Genekspresjonsanalyser
Hva gjør PCR?
Kopiere/amplifisere en DNA sekvens som er tilstede i en kompleks blanding av DNA. Kan produsere store mengder av en gitt DNA-sekvens på kort tid
forklar de tre trinnene i PCR
1: det skjer en denaturering av dna tråden. Denaturering skjer ved at dna deles i to ved at den varmes opp slik at H bindingene mellom trådene brytes.
2: hybridisering (Bindingen av to komplimentære dna molekyler)
2 Primere vil lete seg frem til komplimentære baser på DNA/mRNA osv, dette skjer ved lavere temperaturer siden for høy vil føre til at primeren ikke klarer å binde seg
3: Polymerasen vil binde seg til hver sin 3 ende og starte polemisering av nytt dna tråd
hvilke temperaturer har man ved hver av de tre trinnene i PCR og hvor lang tid bruker man på hver av trinnene?
ved denaturering har man litt over 90 grader
ved hybridisering har man rundt 50-65 grader
ved DNA syntese har man ca 72 grader
man bruker ca 15-60 sek for hvert trinn
hvilke type økning av dna molekyler har man ved PCR?
For hvert dna molekyl kan man danne 2 ekstra det vil si 2^n. da vil det øke eksponentielt
I PCR skal man kopiere spesifikke sekvenser av et dna, altså et gen, men man har ingen stoppsekvens i disse sekvensene så hvordan vet da dna polymerasen når den skal stoppe?
Man har ikke noen stoppsekvens så for å stoppe polimerasen i det området vi vil, altså slutten av det spesifikke genet, øker vi temperaturen. Da vil dna polymerasen slippe/slutte med polemiseringen.
Hvorfor har man et enzymaktiveringstrinn før første syklus i PCR?
I dag er enzymene modifisert slik at den har noe som blokkerer dens aktive sete. Når den varmes opp til en gitt temperatur vil det sete bli borte slik at den kan starte å polemisere. grunnen til at det aktive sete er blokkert er fordi man ikke vil at polymerasen skal starte med polymeriseringen før en viss temperatur.
Hvilke fordeler har man med PCR?
- Rask og enkel metode, enkel apparatur
- flere millioner kopier i løpet av kort tid
- Sensitiv
- krever veldig lite utgangsmateriale
- Robust
- trenger ikke godt renset DNA som templat
- dårlig bevart DNA kan brukes
hvorfor skal Pre- og post-PCR prepareres i separate rom?
Man er bekymret for kontaminering fra den ene prøven til den andre. Siden PCR er en kraftig metode å bruke kan det å få DNA fra en prøve på en annen føre til helt falske resultater.
Hvilke kontroller kan man bruke for PCR?
- positiv prøve
- prøve med alt unntatt DNA/templat (bruker vann istedenfor DNA, for man et utslag på denne så vet man at det er noen galt med testen)
Hva trenger man for å utføre en PCR?
• Templat DNA (målsekvens) • Primere (startsekvens for ny DNA tråd) • typisk lende: 20-25 nt • 2 primere – binder seg til hver sin DNA tråd • spesifikke – ingen homologi med annet DNA • Nukleotider (byggestener) • dATP – deoxyadenosin trifosfat • dCTP - deoxycytidin trifosfat • dGTP – deoxyguanosin trifosfat • dTTP – deoxytymidin trifosfat •DNA polymerase (kopieringsenzym) •varmestabil (fra Thermus aquaticus) •Buffer (pH, salt) og magnesium •PCR maskin (Thermocycler) – ulike temperaturer •Metode for å avlese resultatet
hvilke metoder kan man bruke for å detektere PCR produkter og gi noen fakta om disse metodene
• Agarose gelelektroforese
– Polysakkarid fra alger
– Smeltes og polymeriserer ved avkjøling
– Større DNA fragmenter
• Polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) – Nettverk av akrylamid – Små DNA fragment (<200 nt) – Skiller fragmenter med 1 nt i forskjell – Giftige bestanddeler
• Kapillærelektroforese
– Ulike typer polymer
– En av primerne merkes m/fluoriserende molekyl
– Skiller fragmenter med 1 nt i forskjell
– Analyserer mange prøver samtidig
Hvordan klarer man å fluorisere PCR produkter?
man har stoffer (eks: GelRed). disse stoffene vil legge seg mellom basene på DNA molekylene og når man tilsetter UV lys vil de og dna de har koblet med lyse opp.
se på lenken, hvorfor er det noen punkter som er større/mer lysende enn andre?
https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg
Her er det veldig mye dna med samme størrelse, jo mer dna jo mer fluoriserende materiale binder seg og jo skarpere vises det her
hvis du har et stort molekyl og et lite molekyl, hvem vil komme seg lengst i en gel elektroforesen?
Det er den lille som vil komme seg lengst siden den for minst motstand, elektroosmotisk flow
Hvordan kan man påvise cystisk fibrose (delesjon av dna tråd) ved hjelp av PCR og gel elektroforese?
Det man kan gjør aller først er å isolere dna. Så kan man lage en primer som binder seg til en spesifikk mutasjon. Hvis det ikke skjer en PCR vil det si at primeren ikke har bundet seg til noe og man har da ikke en mutasjon. man kan også se i en elektroforese at en med mutasjon vil komme lengre enn den som ikke har siden den med mutasjon/delesjon er kortere enn den uten
lenken viser en graf for en kapillær elektroforese, beskriv grafen
https://images.slideplayer.no/8/2010152/slides/slide_4.jpg
toppene lengst til høyre er de dna fragmentene som kom kortest altså de største molekylene, selve toppene sier noe om hvor mye dna vi også har. så ifølge denne grafen har vi flest dna fragmenter på slutten av gelet.
Hva er fordelen med multiplex PCR?
Man kan kopiere flere dna sekvenser i samme rør. Man kan ha mange primer par i samme rør og la oss si 4 sett med forskjellige gener. De vil binde seg til hver sin primer slik at polymeriseringen kan begynne på hvert gen. i gel elektroforesen vil da hver av disse nye dna molekylene havne på forskjellige områder pga størrelse og man kan finne ut av hva som er hva
hva er Konvensjonell PCR?
Konvensjonell PCR er den originale metoden av PCR der vi måler endeproduktet
Hvordan får vi kopiert ut det bestemte genet vi vil ha
det skjer ved hjelp av to primere og en dna tråd. Det som skjer er at det først blir festet en primer på starten av genet vi vil kopiere ut fra 3 til 5 ende. siden det ikke er noen stoppsekvens vil hele området fra starten av genet til slutten av dna tråden polymeriseres. deretter vil en annen primer bindet seg til den andre enden av genet i dna tråden. og kopiere fra den ene enden av genet til den andre, den kan ikke kopiere noe mer enn til enden av genet siden det ikke er noe mer å polymerisere der. da har man gått fra halv dna tråder til spesifikke gener
Forklar hvordan gel elektroforese funker
Etter PCR så tilsetter vi en blå farge til dna slik at vi kan se den. Noe annet som tilsette loading bufferen er et par stoffer som gjør at dna blir tyngre slik at den synker litt ned i bufferen, når prøven blir tilsatt bufferen vil man starte strømmen og se hvordan dna blir beveger seg. De korteste dna molekylene vil komme lengst siden de blir minst hindret
