Molekylærbiologiske metoder Flashcards
Fra hvilke kilder kan man isolere DNA og RNA?
- Blodceller, celler fra vev
- Bakterier, virus
- Planter, sopp
Hvorfor isolerer vi dna fra hvite leukocytter og ikke erytrocytter?
erytrocytter har ingen cellekjerne men det har leukocytter
forklar 2 måter DNA/mRNA kan isoleres på fra celle?
først blir DNA brutt ut av cellen, dette gjøres ved bruken av forskjellige proteiner som bryter opp cellemembranen og lyserer cellen. når DNA har kommet seg ut finnes det flere måter å isolere den på.
1: den ene er isolering ved hjelp av kolonne. prøven blir satt på toppen av et kolonne lag av silica. når DNA har blitt brutt løs av cellen vil den sentrifugeres slik at DNA vil binde seg til silica gelet mens overflødig væske vil bli skilt ut. det vil så bli tilsatt en buffer som løsner DNA fra silica gelet og prøven sentrifugeres igjen slik at man nå kan ekstrahere dna-et
2: den neste er isolering med magnetiske kuler. cellen lyserer og vi får tak i dna-et. Magnetiske partikler coatet med DNA/RNA-bindende materiale f.eks til komplementær
base-sekvens tilsettes prøven og DNA/RNA «trekkes ut» vha magnettiske krefter
Hvor har nukleinsyre maks absorbans og hvor har proteiner maks absorbans?
nukleinsyre har maks absorbans ved 260 nm mens proteiner har ved 280 nm
absorbansen til en prøve er 1.0, hva er DNA konsentrasjonen?
dette er en standardisert verdi på
50 µg/ml dobbeltrådet
Hvordan angir man renheten av en dna prøve?
ratioen
OD 260nm / OD 280nm er den lik eller over 1.8 er det bra renhet
Hva er forskjellen på eksonuklease og endonuklease?
– exonukleaser kutter fra enden av DNA tråden og innover
– endonukleaser kutter inne i tråden
Hva gjør enzymet ligase?
– “limer” sammen to ender av DNA-tråden, dvs kobler sammen sukker-fosfat-kjeden (eks lage rekombinant DNA)
OPPGAVE: petter fikk isolert dna og fortynnet prøven med 1+1
abs på 260 nm 0.54
abs på 280 nm 0.3
Hva er konsnetrasjon av dna?
(50 µg/ml*2)/0.54 = 54mikro gram/ml
ganger med to pga av fortynning
Hva er restriksjonsenzymer og hvordan fungerer de?
Er endonukleaser, dvs kutter inne i DNA-tråden. de kutter i spesifikke områder kalt kutteseter/restriksjonssete og som oftest i palindromer (sekvenser som staves det samme fremover og bakover eks OTTO) endonukleasen lager som oftest rette eller klebrige ender av dna som den kutter slik at det blir lettere å sette dem sammen igjen eller med andre tråder
hvordan fungerer revers transkriptase?
det første som skjer er at mRNA blir koblet sammen med komplementære baser på sin 3 ende, dette vil fungere som en promotor. revers transkriptase blir tilsatt slik at den leser av tråden og tilsetter komplementære baser samtidig som den fjerner urasil fra mRNA og erstatter den med Tymin. når det ene trådet blir dannet vil den andre tråden også bli dannet ved hjelp av dna polymerase slik at vi får dannet en dobbel helix
hva er hovedforskjellen på vanlig DNA og cDNA?
cDNA inneholder ikke introner siden de ble kuttet ut da det ble dannet mRNA
forklar hvordan et rekombinant DNA molekyl dannes
først blir plasmide (små ringformet dna molekyler i bakterier) kuttet opp ved hjelp av restriksjonsenzymer. den blir så blandet sammen med dna molekylet som vil klones og som har blitt kuttet med det samme restriksjonsenzymet. endene på molekylene slår seg sammen, siden de er komplementære baser, ved hjelp av dna ligase slik at det blir dannet en helhetlig struktur.
hvorfor blir bare en del av genet (eks insulin) satt inn i en bakterie, og ikke hele genet?
Hadde vi satt inn hele genet hadde vi fått både exons og introns og vi hadde fått et helt annet protein, vi vil bare ha den kodende delen av genet og det betyr at vi bare tilsetter exons til bakterien
