RNAi Knock in/out Flashcards
hva er det RNA Interference gjør? og hvorfor bruker man en SiRNA?
RNA Interference (RNAi /siRNA) hemmer aktiviteten
til spesifikke gener
SiRNA kan brukes til å redusere nivået av et spesifikt mRNA/protein
hvordan danner man SiDNA?
man tilsetter først en dobbeltrådet RNA tråd inn i en organisme. RNA tråden har en nukletidesekvens som sammenfaller med gene som skal inaktiveres. dna tråden kløyves og prosesseres vha RNAi proteiner slik at det blir dannet små dobbeltrådede siRNA molekyler. SiRNA blir delt i to slik at vi får enkelt trådet RNA som hybridiserer med målgenets mRNA og inhiberer dem.
Et kjent gen kan bli fjernet eller erstattet av…..?
Et kjent gen kan bli fjernet eller erstattet av en
annen variant av genet
hvordan kan man tilsette et nytt gen i et dna?
- cDNA klones inn i et plasmid
- Plasmidet produseres i bakterier
- Bakteriekulturen lysere og plasmidet renses
- Palsmidet innføres i cellene
sakt på en annen måte
Kan lage et plasmid som har genet man vil sjekke ut, man setter det inn i en bakterie og dyrker det opp, de bakteriene som har det plasmidet man er interessert i har en annen farge så man kan isolere ut dna til de bakteriene
hva betyr gene knockdown?
det er midlertidig gen inaktivering av vha RNAi
hva er en gen knockout?
det er at aktiviteten av begge allelene til et gen slutter å funke
hvorfor bruker man gen knockout?
det er for å sjekke ut hva et vanlig gen faktisk gjør i kroppen, ved å inaktivere noen gener kan man finne ut av hvilke funksjoner de faktisk hadde i kroppen
hva er gen knock in og hvordan utføres prosessen?
først vil en alternativ versjon av et gen satt inn i en embryootisk stamcelle (ES). i noen av ES vil den alternative versjonen ta plassen til det originale genet. disse cellene kan identifiseres og kultiveres slik ta vi får flere kopier av dem. da vil alle cellene inneholde minst et alternativt gen i en av de to allelene til genet. så vil alle cellene med de alternative genene bli injisert i et muse embryo. noen av musene vil da få utrykt det alternative genet i alle sine celler, disse musene kalles for knock in muser.
forklar hvordan man i knockout selektivt inhibere et gen
det først man gjør er å injisere to modifiserte dna sekvenser inn i et celler. den ene sekvensen inneholder et gen som koder for en recombinase som er under kontroll av en vev spesifikk promotor. promotoren sørger for at rekombinasen bare blir produsert på det spesifikke vevet. den andre sekvensen inneholder genet man er interessert i å studere. genet har blitt flagget med en nukleotidet sekvens som blir gjenkjent av rekombinasen. dyre som dette blir injisert i vil bli modifisert slik at dette blir den eneste versjonen av genet den har. i vev som ikke er interessant for oss vil rekombinase ikke gjøre noe som helst og genet vil oppføre seg som normalt. i målvevet vil promotoren bli aktivert som fører til at rekombinase blir produsert. den vil så binde seg til nukleotide sekvensene som ble tilsatt til målgenet og føre til en rekombinasjons reaksjon som igjen fører til at målgenet vil bli inhibert i det spesifikke vevet.
forklar hvordan man kan bruke CRISPR systemet til å studere genfunksjoner
1: et Cas9 protein sammen med en guide RNA (som viser cas9 hvor den skal ved å binde seg til komplementære baser) Cas9 vil så kutte gene ut av dna tråden slik at et annet modifisert gen kan bli satt inn i stedet vha enzymer som fikser dna brudd, ligaser osv.
2: en annen ting man kan bruke cas9 til er å aktivere eller inaktivere målgener. først modifiserer man cas9 slik at den ikke lenger kan kutte gener. deretter gjør man ting som vanlig (beskrevet over) når guide proteine har bundet seg til sine komplementære baser vil cas9 avhenge av dens funksjon inaktivere eller aktivere sitt mål gen.
