Regulacija glikolize, kompleksa piruvat dehidrogenaze i citratnog ciklusa

Question 1

Zašto se brzina glikolize mora regulirati?

Answer 1

Osnovna uloga glikolize u metabolizmu stanice je razgradnja glukoze u svrhu dobivanja energije za sintezu ATP-a, ali u uvjetima kada stanica ima dovoljno energije međuprodukti i produkti glikolize se koriste kao prekursori za biosintetske reakcije (reakcije sinteze masnih kiselina i aminokiselina). Brzina glikolize se mora regulirati tako da omogući ispunjavanje obiju uloga, a osim toga da bude u skladu sa raspoloživom količinom glukoze.

Question 2

Kako se općenito kreći katabolički procesi u odnosu na energetski nivo stanice? Što signalizira energetski nivo stanice?

Answer 2

Općenito se svi katabolički procesi ubrzavaju kada je razina energije u stanici niska, a usporavaju kada je visoka. Koncentracija ATP-a i reduciranih koenzima, odnosno omjer koncentracija ATP/ADP i NADH/NAD+, signaliziraju kakav je energetski nivo stanice.

Question 3

Čime je signalizirana potreba za prekursorima?

Answer 3

Potreba za prekursorima signalizirana je koncentracijama odgovarajućih međuprodukata koji sudjeluju u biosintetskim reakcijama.

Question 4

Preko kojih enzima se obično regulira brzina nekog metaboličkog puta i što se s tim postiže?

Answer 4

Enzimi preko kojih se regulira brzina određenog metaboličkog puta su obično oni koji kataliziraju praktički ireverzibilne reakcije. Na taj način stanica ujedno štedi energiju ATP-a, sprječavajući njegovo nepotrebno trošenje.

Question 5

Kako se sve aktivnost enzima može regulirati?

Answer 5

Aktivnost enzima se može regulirati alosterički (aktivacija ili inhibicija) ili mehanizmom reverzibilne kovalentne preinake (modifikacije) enzima koja također može djelovati aktivirajuće ili inhibirajuće, a omogućuje i potpunu inaktivaciju enzima. Osim toga se može regulirati i koncentracija enzima u stanici regulacijom brzine transkripcije gena koji
kodiraju za te enzime.

Question 6

Kako se razlikuje vrijeme potrebno za djelovanje određenog mehanizma regulacije?

Answer 6

Vrijeme potrebno za djelovanje određenog mehanizma regulacije je različito – najbrži i najjednostavniji je mehanizam alosteričke regulacije, reverzibilna kovalentna preinaka zahtijeva dulje vrijeme, dok je regulacija transkripcije najsporiji mehanizam regulacije. Alosteričkim mehanizmom se aktivnost enzima regulira kontinuirano i vrlo brzo, ovisno o koncentraciji odgovarajućih supstrata odnosno efektora. Za regulaciju reverzibilnom kovalentnom preinakom su potrebni dodatni enzimi koji će provesti reverzibilnu kovalentnu modifikaciju, tj. katalizirati nastajanje i cijepanje kovalentne veze između efektora (liganda) i enzima čija se aktivnost regulira. Pri tome aktivnosti enzima koji vrše kovalentne modifikacije također moraju biti regulirane odgovarajućim signalima i mehanizmima. Modifikacije nivoa transkripcije gena koji kodiraju za određene enzime zahtijevaju aktivnost proteina regulatora transkripcije (regulatornih proteina), čije aktivnost i/ili koncentracije također moraju biti regulirane na odgovarajuće načine.

Question 7

Preko kojih enzima se regulira brzina odvijanja glikolize i zašto?

Answer 7

Brzina glikolize se regulira preko enzima heksokinaze, fosfofruktokinaze i piruvat kinaze
koji kataliziraju praktički ireverzibilne reakcije glikolize.

Question 8

Kako se regulira aktivnost heksokinaze?

Answer 8

Aktivnost heksokinaze se regulira alosteričkom inhibicijom s glukoza-6-fosfatom (inhibicija produktom). Visoka koncentracija glukoza-6-fosfata signalizira da stanica ima dovoljno energije i preteča za biosintetske reakcije. Koncentracija glukoza-6-fosfata raste kada je inhibirana i fosfofruktokinaza. Inhibicija fosfofruktokinaze uzrokuje nakupljanje fruktoza-6-fosfata koji se onda izomerizira u glukoza-6-fosfat i inhibira daljnju produkciju glukoza-6-fosfata djelovanjem heksokinaze.

Question 9

Koji je ključni enzim za regulaciju brzine glikolize i zašto?

Answer 9

Ključni enzim za regulaciju brzine glikolize je fosfofruktokinaza, budući da katalizira reakciju koja predstavlja tzv. ˝odlučujući korak˝ glikolize. Naime, glukoza-6-fosfat koji nastaje kao produkt reakcije koju katalizira heksokinaza može ući i u druge stanične cikluse (sinteza glikogena, pentoza-fosfatni ciklus), a fruktoza-1,6-bisfosfat isključivo u glikolizu. Regulacija aktivnosti fosfofruktokinaze je najvažnije kontrolno mjesto glikolize.

Question 10

Kako se inhibira fosfofrukto kinaza?

Answer 10

Fosfofruktokinaza je tetramerni alosterički enzim koji se inhibira visokom koncentracijom ATP-a i citrata, a aktivira visokom koncentracijom AMP-a i fruktoza-2,6-bisfosfatom.

Question 11

Objasni utjecaj visokih koncentracija ATP, AMP i citrata na fosfofruktokinazu.

Answer 11

ATP alosterički inhibira enzim smanjujući mu afinitet za vezanje supstrata, dok AMP kao pozitivni regulator poništava inhibicijski učinak ATP-a. AMP omogućuje osjetljiviju kontrolu nego ADP jer male promjene koncentracije ATP-a rezultiraju velikim promjenama koncentracije AMP-a, budući da je ukupna suma koncentracija ATP-a, ADP-a i AMP-a u stanici stalna i da se djelovanjem enzima adenilat kinaze u stanici iz dviju molekula ADP-a regenerira jedna molekula ATP-a uz nastajanje jedne molekule
AMP-a.
Citrat djeluje kao inhibitor fosfofruktokinaze pojačavajući inhibitorno djelovanje ATP-a. Povećana koncentracija citrata ukazuje da u stanici ima dovoljno preteča za sintezu masnih kiselina, što znači da se glikoliza može dodatno usporiti.

Question 12

Što signalizira fruktoza-2,6-bisfosfat?

Answer 12

Fruktoza-2,6-bisfosfat signalizira kakva je koncentracija raspoložive glukoze. Visoka koncentracija glukoze rezultira visokom koncentacijom glukoza-6-fosfata koji izomerizira u fruktoza-6-fosfat. Fruktoza-6-fosfat u visokoj koncentraciji stimulira sintezu fruktoza-2,6 bisfosfata koji onda dodatno aktivira fosfofruktokinazu što rezultira ubrzavanjem glikolize.

Question 13

Kako djeluje fruktoza-2,6-bisfosfat?

Answer 13

Fruktoza-2,6-bisfosfat je alosterički regulator koji pomiče konformacijsku ravnotežu fosfofruktokinaze u smjeru prelaska T oblika u R oblik enzima čime se povećava afinitet fosfofruktokinaze za fruktoza-6-fosfat i smanjuje inhibitorni učinak ATP-a. Fruktoza-2,6-bisfosfat nije međuprodukt glikolize već se sintetizira djelovanjem enzima fosfofruktokinaze 2.

Question 14

Kako se regulira aktivnost fosfofruktokinaze u nedostatku fruktoza-2,6-bisfosfata?

Answer 14

U nedostatku fruktoza-2,6-bisfosfata aktivnost fosfofruktokinaze je regulirana ovisno o potrebama stanice za energijom i biosintetskim pretečama, odnosno ovisno o koncentracijama ATP-a, AMP-a i citrata.

Question 15

Kako nastaje fruktoza-2,6-bisfosfat?

Answer 15

Fruktoza-2,6-bisfosfat nije međuprodukt glikolize već se sintetizira djelovanjem enzima fosfofruktokinaze 2. Fruktoza-2,6-bisfosfat nastaje fosforilacijom fruktoza-6-fosfata u reakciji sa ATP-om, a hidrolizom se fruktoza-2,6-bisfosfat prevodi natrag u fruktoza-6-fosfat.

Question 16

Kakav enzim je fosfofruktokinaza 2? Malo ga opiši.

Answer 16

Fosfofruktokinaza 2 je bifunkcionalni enzim (˝tandem enzim˝) koji sadrži dvije domene: kinaznu (katalizira fosforilaciju fruktoza-6-fosfata u fruktoza-2,6-bisfosfat, tj. ima aktivnost fosfofruktokinaze 2) i fosfataznu (katalizira hidrolitičko odcjepljivanje fosfatne skupine sa drugog C atoma fruktoza-2,6-bisfosfata, tj. ima aktivnost fruktoza-bisfosfataze 2). Aktivnost ovih dviju domena je recipročno regulirana pa nikad ne djeluju istovremeno. Prebacivanje aktivnosti sa jedne domene na drugu je strogo regulirano i kontrolirano zajedničkim signalom, tako da je signal za aktivaciju jedne domene ujedno signal za inaktivaciju druge domene.

Question 17

Koje je zajedničko svojstvo svih bifunkcionalnih enzima?

Answer 17

Zajednička svojstva svih bifunkcionalnih enzima su da u jednom proteinskom lancu imaju dvije domene koje kataliziraju suprotne reakcije i recipročno su regulirane zajedničkim signalom. Najčešće se kao signalni mehanizam koristi kovalentna reverzibilna preinaka, ali može biti i alosterička regulacija.

Question 18

Objasni regulaciju enzima fosfofruktokinaze 2.

Answer 18

U slučaju fosfofruktokinaze 2 signal koji uključuje aktivnost jedne, a istovremeno isključuje aktivnost druge domene je kovalentna reverzibilna preinaka fosforilacijom/defosforilacijom specifičnog serinskog ostatka u regulatornoj regiji enzima. Kod niske koncentracije glukoze aktivira se protein kinaza A (cAMP ovisna protein kinaza) koja fosforilira specifični serinski ostatak fosfofruktokinaze 2 čime se aktivira njena fosfatazna, a inaktivira kinazna domena. Fosfatazna domena tada katalizira reakciju hidrolize fruktoza-2,6-bisfosfata na Pi i fruktoza-6-fosfat. Razgradnjom fruktoza-2,6-bisfosfata nestaje efekt alosteričke aktivacije pa se aktivnost fosfofruktokinaze usporava, a posljedično se usporava i brzina glikolize. Visoka koncentracija glukoze, pa posljedično i fruktoze-6-fosfata, aktivira specifičnu protein fosfatazu koja hidrolitički odcjepljuje fosfatnu skupinu sa serinskog ostatka fosfofruktokinaze 2. Posljedica je aktivacija kinazne domene i inaktivacija fosfatazne domene fosfofruktokinaze 2. Kinazna domena fosfofruktokinaze 2 tada katalizira reakciju fosforilacije fruktoza-6-fosfata u fruktoza-2,6-bisfosfat koji zatim aktivira fosfofruktokinazu i dolazi do ubrzavanja glikolize.

Question 19

Koji je smisao regulacije brzine glikolize sa fruktoza-2,6-bisfosfatom?

Answer 19

Smisao ove regulacije je usklađivanje brzine glikolize sa količinom raspoložive glukoze. U slučaju kada je koncentracija glukoze visoka sintetizira se fruktoza-2,6-bisfosfat i ubrzava glikoliza. Kad je koncentracija glukoze niska razgrađuje se fruktoza-2,6-bisfosfat i prestaje aktivacija fosfofruktokinaze.

Question 20

Koju reakcije katalizira piruvat kinaza?

Answer 20

Piruvat kinaza katalizira zadnju reakciju glikolize u kojoj nastaju ATP i piruvat koji se može dalje razgrađivati u svrhu dobivanja energije ili se koristiti u biosintetskim reakcijama.

Question 21

Zašto se regulira aktivnost piruvat kinaze?

Answer 21

Budući da su sve reakcije u nizu glikolize između reakcije katalizirane fosfofruktokinazom i reakcije katalizirane piruvat kinazom reverzibilne, brzina njihovog odvijanja ovisi o koncentracijama međuprodukata glikolize koji u njima sudjeluju. Stoga se regulacijom aktivnosti zadnjeg enzima u nizu, piruvat kinaze, ujedno kontrolira i brzina odvijanja niza reakcija pretvorbe fruktoza-1,6-bisfosfata u fosfoenolpiruvat.

Question 22

Kako se provodi regulacija piruvat kinaze?

Answer 22

Piruvat kinaza se alosterički inhibira povišenom koncentracijom ATP-a (signalizira visoku razinu energije u stanici) i alanina (signalizira da ima dovoljno preteča za biosinteze). Povećana koncentracija fruktoza-1,6-bisfosfata alosterički aktivira enzim (signalizira da se prvi stupanj glikolize odvija brže od ostatka procesa pa ga je potrebno ubrzati da bi se uskladila brzina odvijanja svih stupnjeva glikolize). U nekim tkivima se aktivnost piruvat kinaze regulira i reverzibilnom kovalentnom preinakom fosforilacijom/defosforilacijom, ovisno o koncentraciji raspoložive glukoze. Pri niskoj koncentraciji glukoze aktivira se protein kinaza A koja fosforilira i time inhibira piruvat kinazu. Pri visokoj koncentraciji glukoze aktivira se protein fosfataza koja defosforilacijom ponovno aktivira piruvat kinazu.

Question 23

Koja reakcija je ključno mjesto u grananju metabolizma i zašto?

Answer 23

Pretvorba piruvata u acetil-CoA je ireverzibilna i nema mogućnosti da se iz acetil-CoA ponovno sintetizira piruvat, a posljedično niti glukoza. Acetil-CoA koji nastaje ovom reakcijom se dalje može potpuno razgraditi do CO2 u citratnom ciklusu ili uputiti u biosintezu masnih kiselina, a razgradnjom masnih kiselina se opet dobije acetil-CoA. Stoga je reakcija koju katalizira kompleks piruvat dehidrogenaze ključno mjesto u grananju metabolizma i zato strogo kontrolirano.

Question 24

Koliko načina regulacije kompleksa piruvat dehidrogenaze imamo? koji su to?

Answer 24

3 - alosterička regulacija, regulacija kovalentnom preinakom te retroaktivna inhibicija.

Question 25

Objasni alosteričku regulaciju kompleksa piruvat dehidrogenaze.

Answer 25

Pri visokoj koncentraciji produkata reakcije kompleksa piruvat dehidrogenaze, NADH i acetil-CoA, dolazi do alosteričke inhibicije produktom. Pri tome acetil-CoA inhibira dihidrolipoil transacetilaznu komponentu (E2), a NADH dihidrolipoil dehidrogenaznu komponentu (E3) kompleksa. Visoka koncentracija acetil-CoA i NADH signalizira da stanica ima dosta energije i da treba usporiti proces sinteze acetil-CoA iz piruvata. Na ovaj način se ujedno štedi glukoza jer se glavnina piruvata sintetizira razgradnjom glukoze

Question 26

Objasni regulaciju kompleksa piruvat dehidrogenaze reverzibilnom kovalentnom preinakom.

Answer 26

U stanicama eukariota osnovni mehanizam regulacije je reverzibilna kovalentna preinaka piruvat dehidrogenazne komponente (E1) fosforilacijom/defosforilacijom. Enzim E1 se
inaktivira fosforilacijom koju katalizira specifična piruvat dehidrogenaze kinaza I (PDK I), a aktivira defosforilacijom koju katalizira specifična piruvat dehidrogenaze fosfataza (PDP). Povećanje omjera koncentracija acetil-CoA/CoA, NADH/NAD+
i ATP/ADP (signaliziraju visoku razinu energije u stanici) dovodi do alosteričke aktivacije piruvat dehidrogenaze kinaze I i time do fosforilacije i inaktivacije E1. S druge strane visoka koncentracija piruvata i ADP-a djeluje inhibirajuće na aktivnost piruvat dehidrogenaze kinaze I.
Povećana koncentracija Ca2+ iona (događa se pri intenzivnom mišićnom radu), kao i hormonalne kaskade koje se aktiviraju adrenalinom i inzulinom, aktiviraju specifičnu piruvat dehidrogenaze fosfatazu koja defosforilira i time aktivira E1. Hormonalna kaskada aktivirana adrenalinom signalizira povećanu potrebu za proizvodnjom energije u stanici, a na aktivnost
piruvat dehidrogenaze fosfataze djeluje posredno na način da povećava koncentraciju Ca2+. Inzulinska kaskada signalizira visoku koncentraciju glukoze, koju treba uskladištiti u formi glikogena ili masnih kiselina. Stoga se aktivacijom piruvat dehidrogenaze fosfataze, koja zatim defosforilira i aktivira piruvat dehidrogenazu, potiče sinteza acetil-CoA koji onda služi kao preteča za sintezu masnih kiselina.

Question 27

Objasni retroaktivnu inhibiciju piruvat dehidrogenazne komponente?

Answer 27

Retroaktivna inhibicija (inhibicija povratnom spregom) je vrsta inhibicije kod koje kao inhibitor enzima ne djeluje molekula koja nastaje kao neposredni produkt reakcije koju katalizira taj enzim, nego kao produkt neke daljnje reakcije koja se u metaboličkom nizu odvija nakon reakcije koju katalizira enzim čija se aktivnost regulira. Visoka koncentracija GTP-a u stanici alosterički inhibira E1, dok je visoka koncentracija AMP-a alosterički aktivira. GTP nastaje u citratnom ciklusu i porast njegove koncentracije u stanici signalizira da stanica ima dosta energije (kada to nije slučaj GTP se odmah prevodi u ATP i koristi kao izvor energije), dok se visoka koncentracija AMP-a pojavljuje kada je ATP potrošen u biosintetskim reakcijama i stanica više nema dovoljno energije.

Question 28

Preko kojih enzima se regulira aktivnost citratnog ciklusa?

Answer 28

Brzina citratnog ciklusa se regulira preko tri enzima: citrat sintaze, izocitrat dehidrogenaze i α-ketoglutarat dehidogenaze

Question 29

Kako se regulira aktivnost citrat sintaze?

Answer 29

Aktivnost citrat sintaze se regulira u prokariotskim stanicama alosteričkom inhibicijom pri visokoj koncentraciji ATP-a.

Question 30

Koja su ključna mjesta regulacije citratnog ciklusa u stanicama eukariota? Opiši regulaciju tih enzima.

Answer 30

U stanicama eukariota su ključna mjesta regulacije alosterički enzimi izocitrat dehidrogenaza i α-ketoglutarat dehidogenaza.
Izocitrat dehidrogenaza se aktivira ADP-om, a inhibira s NADH i ATP-om. αketoglutarat dehidogenazu inhibiraju produkti reakcije sukcinil-CoA i NADH, te visoka koncentracija ATP-a. Sumarno gledano se može reći da visok energijski naboj stanice usporava citratni ciklus.

Question 31

Koje su posljedice inhibicije enzima izocitrat dehidrogenaze i alfa-ketoglutarat dehidrogenaze?

Answer 31

Inhibicija izocitrat dehidrogenaze rezultira nakupljanjem citrata, budući da je reakcija pretvorbe izocitrata u citrat reverzibilna pa se u slučaju nakupljanja izocitrata odvija u povratnom smjeru, a reakcija koju katalizira citrat sintaza je ireverzibilna. Nakupljeni citrat se transportira u citoplazmu (djelovanjem specifičnog transportnog proteina smještenog u membrani mitohondrija) gdje se koristi za sintezu masnih kiselina. Citrat se transportira iz mitohondrija u citosol jedino kada mu je visoka koncentacija u mitohondriju (usljed inhibicije enzima citratnog ciklusa). Povećana koncentracija citrata u citosolu je ujedno signal za usporavanje glikolize (djeluje kao inhibitor fosfofruktokinaze). Inhibicija α-ketoglutarat dehidogenaze rezultira nakupljanjem α-ketoglutarata koji se koristi za biosintezu nekih aminokiselina i purinskih baza.
Na ovaj način se regulacijom kontrolnih točaka citratnog ciklusa postiže povezivanje citratnog ciklusa sa drugim metaboličkim putevima.