Razgradnja proteina i aminokiselina

Question 1

Čime je određena stabilnost staničnih proteina?

Answer 1

Stabilnost (˝vrijeme poluživota˝) staničnih proteina određena je aminokiselinskim ostatkom na amino-terminalnom kraju.

Question 2

Za što se koristi višak aminokiselina koji se ne koristi za biosinteze?

Answer 2

Višak aminokiselina (koji se ne iskoristi za biosinteze) se ne može uskladištiti niti izlučiti nego se upotrebljava kao metaboličko gorivo.

Question 3

Kojim enzimima se razgrađuju proteini?

Answer 3

Proteini se razgrađuju djelovanjem proteolitičkih enzima (proteaza, proteinaza) koji hidrolitički cijepaju peptidne veze u molekuli proteina.

Question 4

Nabroji neke kriterije prema kojima se dijele proteolitički enzimi.

Answer 4

Proteolitički enzimi se dijele u skupine prema različitim kriterijima kao što su:
- položaj veze koju cijepaju u peptidnom lancu;
- lokalizacija u stanici/organizmu;
- grupe u aktivnom mjestu enzima koje su neophodne za aktivnost;
- strukturne karakteristike, itd.

Question 5

Kako se dijele proteaze prema položaju veze u peptidnom lancu koje cijepaju?

Answer 5

Prema položaju veze u peptidnom lancu koje cijepaju proteolitički enzimi se dijele na egzopeptidaze (odcjepljuju aminokiseline sa krajeva lanca i to aminopeptidaze sa aminoterminalnog, a karboksipeptidaze sa karboksiterminalnog kraja peptidnog lanca) i endopeptidaze (cijepaju peptidne veze u unutrašnjosti peptidnog lanca).

Question 6

Kako se dijele proteaze prema lokalizaciji u stanici?

Answer 6

Prema lokalizaciji u stanici ili organizmu se dijele na intracelularne (periplazmatske, membranske, citosolne) i ekstracelularne proteolitičke enzime.

Question 7

Kako se proteaze dijele prema reaktivnim kemijskim grupama u aktivnom mjestu enzima koje su neophodne za njenu aktivnost?

Answer 7

Prema reaktivnim kemijskim grupama u aktivnom mjestu enzima koje su neophodne za aktivnost proteinaze se dijele na:
- serinske - kod kojih je za aktivnost kritična -OH skupina serina (kimotripsin, tripsin)
- cisteinske (tiolne) - kod kojih je za aktivnost kritična -SH skupina cisteina (papain)
- aspartatne - kod kojih je za aktivnost kritična -COO–
skupina aspartata (pepsin)
- metaloproteaze - kod kojih je za aktivnost kritičan metalni ion (karboksipeptidaza, kolagenaza).

Question 8

Kako djeluju proteolitički enzimi? Navedi primjere.

Answer 8

Proteolitički enzimi na svojim supstratima prepoznaju određene regije, odnosno određene aminokiselinske ostatke koji se mogu smjestiti u vezno mjesto za supstrat unutar njihovih aktivnih mjesta, te cijepaju peptidne veze na C-terminalnoj strani tih ostataka.
Tako npr. kimotripsin cijepa peptidne veze iza aromatskih aminokiselinskih ostataka fenilalanina, triptofana i tirozina čiji se veliki hidrofobni pobočni ogranci mogu smjestiti u duboki hidrofobni džep za vezanje supstrata u aktivnom mjestu kimotripsina. Tripsin cijepa veze iza ostataka arginina i lizina čiji se bazični pobočni ogranci vežu u procjep aktivnog mjesta koji sadrži kiseli ostatak aspartata. Elastaza cijepa veze iza aminokiselinskih ostataka s malim pobočnim lancima kao što su alanin, glicin i serin koji mogu ući u uski procjep enzima.

Question 9

Što je bitno za katalitičku aktivnost enzima?

Answer 9

Za katalitičku aktivnost proteolitičkih enzima, kao i svih enzima, bitni su određeni aminokiselinski ostaci u aktivnom mjestu, koji sadrže reaktivne kemijske grupe kao i njihov prostorni raspored.

Question 10

Što je neophodno za katalitičku aktivnost serinskih peptidaza?

Answer 10

Za katalitičku aktivnost serinskih peptidaza neophodni su ostaci serina, histidina i aspartata u aktivnom mjestu, raspoređeni tako da tvore trijadu povezanu H-vezama.

Question 11

Kako se brzina proteolize mijenja tijekom aktivnosti proteolitičkog enzima?

Answer 11

Proteinski lanci se cijepaju postepeno, počevši od veza između aminokiselinskih ostataka na površini molekule koje su dostupne djelovanju proteolitičkog enzima, pa je u početku brzina proteolize mala. Nakon cijepanja određenog broja veza protein se razmata pa je sve više peptidnih veza dostupno djelovanju proteolitičkog enzima i brzina proteolize se povećava.

Question 12

Do koje nepoželjne pojave može doći tijekom aktivnosti proteolitičkih enzima?

Answer 12

Budući da proteolitički enzimi ne ˝prepoznaju˝ supstrat kao cijelu molekulu već samo određene aminokiselinske ostatke značajna je mogućnost autolize proteolitičkih enzima.

Question 13

U kakvom obliku se sintetiziraju mnoge proteaze?

Answer 13

Mnogi proteolitički enzimi se sintetiziraju u inaktivnom, tzv. zimogenom obliku i prevode u aktivnu konformaciju kontroliranom hidrolizom jedne ili nekoliko peptidnih veza (parcijalna proteoliza). Aktivacija zimogena je ireverzibilna.

Question 14

Na koje načine se može regulirati aktivnost proteolitičkih enzima?

Answer 14

Jedan način je njihova sinteza u zimogenom obliku nakon čega je potrebna njihova aktivacija parcijalnom proteolizom. Aktivnost proteolitičkih enzima se može regulirati i preko specifičnih proteina koji djeluju kao inhibitori (nrp. inhibicija tripsina sa tripsin inhibitorom, elastaze sa alfa ihibitorom).

Question 15

Koje uloge imaju proteolitički enzimi u intracelularnom katabolizmu proteina?

Answer 15

Proteolitički enzimi imaju važne uloge u intracelularnom katabolizmu proteina kao što su normalni obrtaj proteina (razgradnja nepotrebnih proteina- npr.regulatornih proteina u uvjetima kada njihova aktivnost nije potrebna kako bi se spriječilo njihovo gomilanje u stanici), uklanjanje defektnih proteina (proteini sa greškom u translaciji ili smatanju u nativnu konformaciju), postsintetske modifikacije proteina i aktivacija zimogena.

Question 16

Kako stanica prepoznaje da neki protein više nije potreban ili je oštećen?

Answer 16

tanični proteini koji više nisu potrebni ili su oštećeni obilježavaju se vezanjem malog proteina ubikvitina izopeptidnom vezom na amino-grupe pobočnih ogranaka lizina u proteinu koji treba razgraditi. Na prvu molekulu ubikvitina dodaje se još nekoliko molekula ubikvitina povezanih izopeptidnim vezama. Ubikvitinom obilježeni proteini se razgrađuju u proteasomu.

Question 17

Koji enzimi sudjeluju u vezanju ubikvitina na protein?

Answer 17

Vezanje ubikvitina na protein se odvija u nekoliko koraka koje kataliziraju ubikvitin-aktivirajući enzim (E1), ubikvitin-konjugirajući enzim (E2) i ubikvitin-protein ligaza (E3).

Question 18

Objasni razlike u količini E1, E2 i E3 enzima koje stanica posjeduje.

Answer 18

Većina eukariota ima samo jedan ili nekoliko E1 enzima, a veliki broj različitih E2 i E3 enzima. Veliki broj različitih E3 enzima je posljedica postojanja različitih ciljnih proteina koje je potrebno obilježiti ubikvitinom za razgradnju, a koje E3 mora vezati u svoje aktivno mjesto. Veliki broj različitih E2 enzima je potreban kako bi mogli stvoriti kompleks sa različitim E3 enzimima, dok je E1 dovoljna samo jedna vrsta jer ima samo ulogu aktivacije ubikvitina.

Question 19

Objasni proces vezanja ubikvitina na protein.

Answer 19

Ubikvitin-aktivirajući enzim (E1) aktivira ubikvitin (nukleofilni napad C-terminalne grupe ubikvitina na ATP, pri čemu nastaje ubikvitin-adenilat i oslobađa se PPi) i veže ga na svoj cisteinski ostatak tioesterskom vezom. U sljedećoj reakciji ubikvitin-konjugirajući enzim (E2) preuzima ubikvitin sa E1 i veže ga na svoj cisteinski ostatak tioesterskom vezom. Nakon toga E2 ulazi u kompleks sa ubikvitin-protein ligazom (E3) koja katalizira prijenos ubikvitina sa E2 na amino grupu ostatka lizina u ciljnom proteinu. E3 ostaje vezan na ciljni protein i produljuje lanac vezanih ubikvitina dodajući nove molekule ubikvitina na lizinski ostatak (Lys48) prethodno vezanog ubikvitina.

Question 20

Kako se razgrađuju ubikvitinom obilježeni proteini?

Answer 20

Ubikvitinom obilježeni proteini se razgrađuju u proteasomu. Proteini se u proteasomu razgrađuju na peptide duge 7- 9 aminokiselina. Izopeptidaza sa peptida odcjepljuje molekule ubikvitina koje se ponovo koriste za obilježavanje novih molekula proteina, a peptidi se dalje razgrađuju u citosolu

Question 21

Objasni građu proteasoma.

Answer 21

Proteasom je kompleks proteolitičkih enzima (26S) u kojem su katalitička mjesta okrenuta u unutrašnjost strukture katalitičke jedinice (20S). Ulazak proteina u unutrašnjost proteasoma kontrolira regulatorna jedinica (19S) koja specifično veže poliubikvitinske lance

Question 22

Kako započinje razgradnja aminokiselina?

Answer 22

Razgradnja aminokiselina započinje uklanjanjem α-amino skupine reakcijom transaminacije, tako da se amino skupina prebaci na neku α-ketokiselinu.

Question 23

Koju prostetsku skupinu sadrže transaminaze? Nacrtaj ju.

Answer 23

Transaminaze sadrže prostetsku skupinu piridoksal-fosfat (PLP).

Question 24

Koje reakcije katalizira glutamat dehidrogenaza?

Answer 24

Glutamat nastao transaminacijom se oksidacijski deaminira, pri čemu se oslobađa NH4+-ion i regenerira α-ketoglutarat. Reakciju katalizira glutamat dehidrogenaza koja kao koenzim koristi NAD+.
Glutamat dehidrogenaza katalizira i reverzibilnu reakciju reduktivne aminacije α-ketoglutarata, ali u toj reakciji koristi koenzim NADPH.

Question 24

Navedi neke transaminaze i njihove reakcije (nacrtaj).

Answer 24

U većini slučajeva akceptor amino skupine je α-ketoglutarat, koji se tako prevodi u glutamat. Enzim koji katalizira ovu reakciju je glutamat transaminaza.
Aspartat transaminaza katalizira prijenos amino-skupine na oksaloacetat, a alanin transaminaza na piruvat.

Question 25

Za što se koriste ugljikovi atomi deaminiranih kiselina?

Answer 25

Ugljikovi atomi deaminiranih aminokiselina prevode se u piruvat i međuprodukte ciklusa limunske kiseline (tzv. glukogene aminokiseline) ili u acetil-CoA i acetoacetat (tzv. ketogene aminokiseline)

Question 26

Za što se koriste oslobođeni amonijevi ioni?

Answer 26

Oslobođeni amonijevi ioni ugrađuju se u biomolekule.

Question 27

Koje molekule su važni donori dušika u biosintezi velikog broja spojeva sa dušikom?

Answer 27

Glutamat i glutamin.

Question 28

Kako nastaje glutamin. Nacrtaj reakciju.

Answer 28

Reakciju sinteze glutamina iz glutamata i amonijeva iona katalizira glutamin sintetaza, a potrebna energija se osigurava cijepanjem ATP-a.

Question 29

Kako se regulira aktivnost glutamin sintetaze?

Answer 29

Regulacija aktivnosti glutamin sintetaze je primjer kompleksne regulacije putem dva mehanizma kontrole. Enzim se regulira kumulativnom povratnom inhibicijom (retroaktivnom inhibicijom) i
reverzibilnom kovalentnom modifikacijom adenililacijom. Glutamin sintetaza je građena od 12 podjedinica, koje sadrže specifična mjesta za vezanje pojedinih inhibitora, a to su konačni produkti biosintetskih puteva u kojima je glutamin donor amino skupine. Ovi spojevi kontroliraju aktivnost glutamin sintetaze alosteričkim mehanizmom. Pri tome je djelovanje ovih inhibitora kumulativno (zbraja se), a niti jedan od inhibitora ne može samostalno u potpunosti inhibirati aktivnost glutamin sintetaze. Što je veći broj inhibitora i što su više njihove koncentracije inhibicijski efekt će biti jači. Reakciju adenililacije kao i deadenililaciju glutamin sintetaze katalizira tandem enzim adenilil transferaza (AT). Ovaj enzim djelovanjem svoje adenililacijske domene veže AMP na specifični tirozinski ostatak na svaku podjedinicu glutamin sintetaze, što glutamin sintetazu čini osjetljivijom na djelovanje inhibitora. Deadeniliacijska domena AT fosforolitički otcjepljuje AMP sa glutamin sintetaze što glutamin sintetazu čini manje osjetljivom na djelovanje inhibitora.

Question 30

Koja je svrha takve kompleksnije regulacije adenilil trasferaze?

Answer 30

Svrha ove regulacije je da se osigura sinteza određene količine glutamina koja je potrebna za sintezu proteina čak i kada glutamin nije potreban za sintezu ostalih spojeva za koje je donor amino grupe. Stoga, čak i kada su u stanici prisutni svi alosterički inhibitori u visokim koncentracijama to neće rezultirati potpunim zaustavljanjem djelovanja glutamin sintetaze ukoliko ona nije adenililrana, jer je tada
manje osjetljiva na djelovanje inhibitora i enzim će zadržati određenu razinu aktivnosti.

Question 31

Kako je regulirana aktivnost adenilil trasferaze?

Answer 31

Aktivnost adenilil transferaze se recipročno regulira putem regulacijskog proteina (P) koji podliježe kovalentnoj reverzibilnoj modifikaciji - uridinililaciji. Vezanje uridin monofosfata (UMP) na regulacijski protein P dovodi do promjene konformacije ovog proteina, a reakciju uridililacije i deuridililacije katalizira tandem enzim uridilil transferaza. Kada je protein P uridililiran prelazi u D konformaciju (PD), a kada je deuridililiran zauzima A konformaciju (PA). Regulatorni protein svojom interakcijom sa adenilili transferazom regulira koja će od domena adenilil transferaze biti aktivna. Tako je u slučaju kada je na AT vezan regulatorni protein u PA konformaciji aktivna adenililacijska, a inaktivna deadenililacijska domena adenilil transferaze. Nasuprot tome, kada je na AT vezan regulatorni protein u PD konformacijski aktivna je deadenililacijska, a inaktivna adenililacijska domena adenilil transferaze. Adenililacijska domena veže AMP na glutamin sintetazu, što rezultira povećanjem osjetljivosti glutamin sintetaze na djelovanje inhibitora. U takvim uvjetima niže koncentracije inhibitora i manji broj inhibitora imaju jači inhibitorni efekt na glutamin sintetazu. S druge strane deadenililirana glutamin sintetaza je manje osjetljiva na djelovanje inhibitora, pa će biti potrebne veće koncentracije i veći broj inhibitora za jednak inhibitorni efekt na glutamin sintetazu. Stoga je adenililirana glutamin sintetaza manje aktivna, a deadenililirana glutamin sintaza više aktivna.

Question 31

Kako je regulirana aktivnost uridilil trasferaze?

Answer 31

Aktivnost uridilil transferaze, koja je također bifunkcionalni enzim i ima dvije domene koje kataliziraju suprotne reakcije, se regulira alosteričkim mehanizmom: uridililacijsku domenu aktiviraju ATP i α-ketoglutarat, a inhibira glutamin; deuridililacijsku domenu aktivira glutamin, a inaktivira α-ketoglutarat

Question 32

Opiši aktivnost enzima koju reguliraju količini glutamina u stanici u uvijetima visokih i niskih koncentracija α-ketoglutarata i ATP-a.

Answer 32

U uvjetima kada je visoka koncentracija α-ketoglutarata i ATP-a, a niska koncentracija glutamina bit će aktivna uridililacijska domena uridilil transferaze koja veže UMP na P protein, čime on prelazi iz A u D konformaciju. Posljedica je da PD aktivira deadenililaciju glutamin sintetaze, čime ona postaje manje osjetljiva na djelovanje inhibitora tj. aktivnija. Takvo djelovanje će dovesti do povećanja koncentracije glutamina u stanici. Nasuprot tome kada je u stanici visoka koncentracija glutamina, a niska koncentracija α-ketoglutarata aktivna je deuridililacijska domena uridilil transferaze koja će hidrolitički odcjepiti UMP sa regulatornog proteina i prevesti ga iz PD u PA konformaciju. To dovodi do adenililacije glutamin sintetaze i posljedično njene veće osjetljivosti na djelovanje inhibitora i manje aktivnosti, što će u konačnici rezultirati smanjenjem sinteze glutamina.