Ciklus limunske kiseline

Question 1

Što je ciklus limunske kiseline? Gdje se odvija, uloga?

Answer 1

Ciklus limunske kiseline (citratni ciklus, Krebsov ciklus) je zajednički završni put oksidacije molekula dobivenih razgradnjom ugljikohidrata, masnih kiselina i aminokiselina. Većina molekula ulazi u ovaj ciklus u obliku acetil-CoA. Citratni ciklus se odvija u matriksu mitohondrija isključivo u aerobnim uvijetima. Osnovna uloga mu je dobivanje energije oksidacijom molekula supstrata.
Međutim, ovaj ciklus je i važan izvor prekursora za sintezu aminokiselina, nukleotidnih baza i porfirina.

Question 2

Što se dešava u citratnom ciklusu?

Answer 2

Citratni ciklus čini osam povezanih reakcija kojima se acetilna jedinica oksidira do 2 CO2 , a energija oslobođena oksidacijom se akumulira u obliku reduciranih koenzima FADH2 i NADH. Dobiveni reducirani koenzimi se nakon toga oksidiraju u procesu oksidacijske fosforilacije, a energija oslobođena njihovom oksidacijom se koristi za sintezu ATP-a. Stoga se može reći da je svrha citratnog ciklusa prikupljanje visokoenergetskih elektrona iz ugljikovih spojeva.

Question 3

Nacrtaj i nabroji sve reakcije citratnog ciklusa.

Answer 3

1. Aldolna kondenzacija acetilne jedinice i oksaloacetata. Nastaje citrat, enzim citrat-sintaza
2. Dehidratizacija pa hidratizacija citrata, nastaje izocitrat, enzim akonitaza
3. Oksidacijska dekarboksilacija izocitrata u α-ketoglutarat, enzim izocitrat-dehidrogenaza
4. Oksidacijska dekarboksilacija α-ketoglutarata u sukcinil-CoA, enzim α-ketoglutarat-dehidrogenaza
5. Fosforolitičko cijepanje sukcinil-CoA na sukcinil i CoA, enzim sukcinil-CoA sintetaza
6. Oksidacija sukcinila u fumarat, enzim sukcinat dehidrogenaza
7. Hidratiziranje fumarata u malat, enzim fumaraza
8. Oksidacija malata u oksaloacetat, enzim malat dehidrogenaza

Question 4

Nacrtaj i objasni prvu reakciju citratnog ciklusa. Kako djeluje enzim citrat sintaza?

Answer 4

Prva reakcija ciklusa je aldolna kondenzacija acetilne jedinice, koja u ciklus ulazi u formi acetil-CoA, i oksaloacetata (C4 jedinice), pri čemu nastaje citrat (C6 jednica). Reakciju katalizira enzim citrat sintaza.
Citrat sintaza djeluje mehanizmom ˝izazvanog pristajanja˝ (˝induced fit˝), pri čemu molekulu supstrata zatvara u aktivno mjesto kako bi onemogućila pristup vode i nepoželjnu hidrolizu tioesteske veze u acetil-CoA. U aktivno mjesto enzima se prvo veže oksaloacetat, što izaziva konformacijsku promjenu aktivnog mjesta i tek se time formira vezno mjesto za acetilCoA. Supstrati se dovode na odgovarajuću razdaljinu i pravilno
orijentiraju jedan prema drugome, te se polariziraju u interakcijama sa određenim aminokiselinskim ostatcima u aktivnom mjestu enzima kako bi došlo do njihovog povezivanja u međuprodukt citril-CoA. Tijekom odvijanja ove reakcije prvo nastaje enolni međuprodukt interakcijom acetilne grupe acetil-CoA sa karboksilnom grupom Asp375 i imidazolnom grupom His274 u aktivnom mjestu enzima. Oksaloacetat se također aktivira primanjem H+ na
karbonilnu grupu, pri čemu je donor H+ imidazolna grupa His320. Istovremenim napadom enolnog
međuprodukta acetil-CoA na karbonilni ugljik oksaloacetata dolazi do stvaranja kovalentne C-C veze između oksaloacetata i enolnog međuprodukta i nastajanja citril-CoA. Nakon toga dolazi do još jedne promjene konformacije aktivnog mjesta što omogućuje pristup molekuli vode koja hidrolitički odcjepljuje CoA iz citril-CoA i nastaje konačni produkt reakcije citrat.

Question 5

Je li prva reakcija citratnog ciklusa reverzibilna i zašto?

Answer 5

Reakcija je ireverzibilna jer se hidrolizom tioesterske veze citril-CoA oslobađa velika količina energije što pomiče ravnotežu reakcije u smjeru nastajanja citrata.

Question 6

Kako nastaje enolni međuprodukt u enzimu citrat sintai?

Answer 6

Interakcijom acetilne grupe acetil-CoA sa karboksilnom grupom Asp375 i imidazolnom grupom His274 u aktivnom mjestu enzima.

Question 7

Nacrtaj i objasni reakciju koja slijedi nakon one kataliziranom citrat sintazom.

Answer 7

Citrat se u sljedećoj reakciji dehidratizira u cis-akonitat koji se zatim hidratizira u izocitrat. Reakciju katalizira enzim akonitaza, a svrha ove reakcije je prebacivanje –OH grupe sa trećeg C atoma na drugi C atom u molekuli izocitrata, budući da položaj –OH grupe na trećem C atomu citrata onemogućuje odvijanje reakcije oksidacijske dekarboksilacije koja se događa u sljedećoj reakciji citratnog ciklusa.

Question 8

Koja reakcija slijedi nakon one katalizirane enzimom akonitaza? Nacrtaj i objasni ju.

Answer 8

Nakon dehidratiziranja i hidratiziranja citrata u izocitrat sljedi reakcija oksidacijske dekarboksilacije izocitrata u α-ketoglutarat koju katalizira enzim izocitrat dehidrogenaza. Ovaj enzim, za razliku od velikog broja dekarboksilaza, ne koristi TPP kao
prostetsku grupu nego reakcija teče na način da se izocitrat prvo oksidira u oksalosukcinat uz koenzim NAD+ koji djeluje kao oksidans. Nakon oksidacije izocitrata u oksalosukcinat slijedi dekarboksilacija oksalosukcinata, koji je nestabilna β-ketokiselina, u stabilni αketoglutarat.

Question 9

Zašto je reakcija koju katalizira akonitaza bitna za odvijanje reakcije oksidacijske dekarboksilacije u sljedećem koraku katalizirana enzimom izocitrat dehidrogenaza.

Answer 9

Budući da se u reakcijama oksidacije –OH grupe jedan vodik uzima sa same –OH grupe, a drugi vodik sa istog C atoma na koji je vezana –OH grupa, ova reakcija ne bi bila moguća bez prethodne izomerizacije citrata u izocitrat (jer citrat nema –OH
grupu u odgovarajućem položaju za oksidaciju)

Question 10

Nacrtaj i opiši reakciju koja slijedi nakon oksidacijske dekarboksilacije enzimom izocitrat dehidrogenaza.

Answer 10

U sljedećoj reakciji dolazi do oksidacijske dekarboksilacije α-ketoglutarata u sukcinil-CoA.
Ovu reakciju katalizira kompleks α-ketoglutarat dehidrogenaze. Mehanizam djelovanja kompleksa α-ketoglutarat dehidrogenaze je identičan mehanizmu djelovanja kompleksa piruvat dehidrogenaze. Enzimske komponente kompleksa α-ketoglutarat dehidrogenaze (E1, E2 i E3) imaju jednake funkcije kao i komponente E1, E2 i E3 kompleksa piruvat dehidrogenaze i djeluju uz iste prostetske skupine (TPP, lipoamid, FAD) i koenzime (CoA i NAD+). Jedina je razlika što je supstrat ovog kompleksa ketokiselina sa 5 C atoma (α ketoglutarat) umjesto ketokiseline sa 3 C atoma (piruvat), pa kao produkt nastaje acil-CoA sa 4 C atoma (sukcinil-CoA) umjesto sa 2 C atoma (acetil-CoA).

Question 11

Nacrtaj reakciju kojsa slijedi nakon oksidacijske dekarboksilacije enzimom α-ketoglutarat dehidrogenaza.

Answer 11

Sukcinil-CoA se fosforolitički cijepa na sukcinat i CoA uz fosforilaciju GDP-a u GTP. Reakciju katalizira enzim sukcinil-CoA sintetaza. U ovoj reakciji se energija tioesterske veze sukcinil-CoA transformira u potencijal prijenosa fosfatne grupe, tj. na račun cijepanja tioesterske veze dolazi do sinteze GTP-a iz GDP-a i Pi. U aktivnom mjestu sukcinil-CoA sintetaze se ortofosfat (Pi) aktivira interakcijom sa jednim
ostatkom histidina i napada tioestersku vezu sukcinil-CoA. Tom reakcijom se oslobađa
CoA i nastaje sukcinil-fosfat u kojem je energija tioesterske veze sačuvana u anhidridnoj vezi
između karboksilne grupe sukcinata i Pi. Nakon toga se Pi grupa iz sukcinil-fosfata veže energijom bogatom vezom na histidinski ostatak u aktivnom mjestu enzima, a sukcinat izlazi iz aktivnog mjesta. Pri tome dolazi do pomaka fosforiliranog ostatka histidina koji time dolazi u interakciju sa molekulom GDP-a vezanom u drugom dijelu aktivnog mjesta. Konačno se fosfatna grupa sa histidinskog ostatka predaje na GDP i nastaje GTP kao drugi produkt reakcije.

Question 12

Kakva je reakcija koju katalizira enzim sukcinil-CoA-sintetaza.

Answer 12

Ovo je reakcija fosforilacije na razini supstrata. Reakcija je reverzibilna jer u svim koracima reakcije
sudjeluju međuprodukti bogati energijom. Ujedno je ovo jedina reakcija citratnog ciklusa u kojoj
izravno nastaje energijom bogati nukleotid trifosfat GTP, koji je direktni ekvivalent ATP-a. Sumarno gledano u ovoj reakciji je energija tioesterske veze iskorištena za sintezu anhidridne veze u molekuli GTP-a.

Question 13

Nacrtaj i opiši reakciju nakon fosforolitičkog cijepanja sukcinil-CoA.

Answer 13

Sukcinat se dalje oksidira u fumarat u reakciji koju katalizira sukcinat dehidrogenaza uz FAD kao oksidans. U ovoj reakciji se kao oksidans koristi FAD, a ne NAD+ kao u ostalim oksidoredukcijskim reakcijama citratnog ciklusa, jer energija koja se oslobodi oksidacijom sukcinata nije dovoljna za redukciju NAD+.

Question 14

Koji enzim je vezan na unutrašnju membranu
mitohondrija i direktno predaje elektrone sa FADH2 u proces oksidacijske fosforilacije?

Answer 14

Sukcinat dehidrogenaza

Question 15

Nacrtaj i opiši reakciju koja slijedi nakon oksidacije sukcinata.

Answer 15

Fumarat se zatim hidratizira u malat u reakciji koju
katalizira enzim fumaraza

Question 16

Nacrtaj i opiši reakciju koja slijedi nakon hidratizacije fumarata.

Answer 16

Malat se na kraju oksidira u oksaloacetat uz oksidans NAD+. Oksidaciju malata u oksaloacetat katalizira enzim malat dehidrogenaza. Reakcija koju katalizira malat dehidrogenaza ima pozitivan ΔG, što znači da bi se reakcija spontano odvijala u suprotnom smjeru (redukcija oksaloacetata u malat). Međutim, budući da se oksaloacetat odmah odvodi u sljedeću reakciju (kondenzaciju sa acetilnom jedinicom), a NADH odmah oksidira u procesu oksidacijske fosforilacije, reakcija teče u smjeru nastajanja oksaloacetata. Međutim, u uvjetima kada stanica ima dovoljno energije i dođe do nakupljanja oksaloacetata i NADH, ova reakcija će teći u smjeru redukcije oksaloacetata u malat.

Question 17

Što se postiže nizom reakcija od sukcinata do oksaloacetata.

Answer 17

Ovim nizom reakcija se osim crpljenja energije iz supstrata ujedno regenerira
oksaloacetat potreban za odvijanje prve reakcije citratnog ciklusa.

Question 18

Koje se molekule citratnog ciklusa odvode u biosintetske reakcije u uvjetima kada stanica ima dovoljno energije?

Answer 18

Odvode se sukcinil-CoA (preteča za sinteze porfirina, hema i klorofila),
oksaloacetat (za sintezu purina, pirimidina i aminokiselina),
citrat (preteča za sintezu masnih kiselina i sterola),
α-ketoglutarat (preteča za sintezu aminokiselina i purina)

Question 19

Kako se nadoknađuju međuprodukti citratnog ciklusa koji se odvode u biosintetske reakcije?

Answer 19

Nadopunjavanje ciklusa se najčešće događa tako da se iz piruvata, fosfoenolpiruvata ili iz određenih aminokiselina sintetizira oksaloacetat (vidi kasnije), odnosno iz određenih aminokiselina α-ketoglutarat (vidi kasnije).

Question 20

Zbirna jednadžba citratnog ciklusa

Question 21

Na koje reakcije se potroše molekule vode?

Answer 21

Hidroliza citril-CoA i hidratacija fumarata

Question 22

Koliko elektrona i protona i u kojim reakcijama dobivamo u citratnom ciklusu?

Answer 22

U citratnom ciklusu se odvijaju 4 reakcije oksidacije kojima se crpi 8 elektrona i 4 para H+.

Question 23

Zašto se u reakciji oksidacije sukcinata kataliziranom sukcinat dehidrogenazom kao oksidans koristi FAd, a ne NAD+ kao u većini reakcija oksidacije?

Answer 23

U ovoj reakciji se kao oksidans koristi FAD, a ne NAD+ kao u ostalim oksidoredukcijskim reakcijama citratnog ciklusa, jer energija koja se oslobodi oksidacijom sukcinata nije dovoljna za redukciju NAD+.