Realtids-PCR Flashcards
Förklara hur realtids-PCR fungerar som baseras på primers och fluorescens-inmärkt probe (s.k. Taqman-kemi)
Kräver primer, taq-polymeras och prob med reporter och quencher.
Taq-polymeras förlänger sträng+primer. Reportern lossnar och quenchern förflyttas bort från reportern = reportern kan fluoroscera.
Om quenchern är för nära reportern slukar den dess ljus = ingen fluoroscens.
Vad menas med en quencher?
En quencher finns på samma prob som reportern. Om denna befinner sig på nära avstånd från reportern så tar den upp all energi av reportern, vilket gör att reportern ej fluoroscerar.
Hur fungerar infärgning av DNA med SYBRgreen
SYBRgreen är naturligt fluoroscerande. Binder in i ds-DNA i minor groove i dubbelhelixen och blir ännu mer fluoroscerande än i fritt tillstånd. Kräver ingen prob då den binder in under elongeringen.
Känna till när det kan vara ett bra alternativ att använda sig av SYBRgreen detektion istället för primer/probe-detektion
Om det saknar konserverade regioner på DNA fungerar ej primer/probe.
Känna till fördelarna med realtids-PCR jämfört med en klassisk PCR
- tidsbesparande
- kräver inga geler
- mindre kontaminationsrisk
- standardkurvor
- man kan kvantifiera molekyler - gör att man kan följa behandling av antivirala medel/antibiotika eller följa cancermarkörer under medicinsk behandling
Förklara vad som menas med multiplex PCR
Innebär att man kan amplifiera flera DNA-sekvenser samtidigt. För detta används specifika primers och olika prober med reporters som finns långt ifrån varandra för att senare kunna tyda resultaten
Ge exempel på när det rent kliniskt kan vara bra att utnyttja möjligheten att kvantifiera sina prov (DNA-produkter) med realtids-PCR
- kunna följa behandlingar av antivirala medel eller antibiotika
- att kunna följa cancermarkörer under behandling
