cDNA-kloner och sekvensering Flashcards
Vad står rDNA för?
Rekombinant DNA
Vad är ett genbibliotek?
Samling DNA-fragment som genom molekylär kloning förvaras och propageras i mikroorganismer
Vad är ett genomiskt bibliotek?
En samling av det totala genomet från en cell som förvaras i en vektor.
Vad är cDNA?
Kommer från mRNA som används för att göra cDNA
Vad är ett cDNA-bibliotek?
Identifiera gener som uttrycks vid ett visst förhållande eller i en viss cell/vävnad, identifiera nya eller homologa gener
Vad används det genomiska biblioteket till?
Genomsekvenseringar, kartläggning av studier, promotor-studier
Hur konstruerar man ett cDNA-bibliotek?
- Isolera total-RNA från cell eller vävnad
- Tillsätt oligo dT primer, binder till mRNA
- Tillverka en ss-cDNA mha RT och dNTPs
- Degradera mRNA mha RnaseH eller NaOh
- Tillverka den andra strängden (ds-cDNA) mha DNA-polymeras I och dNTPs.
- Klona cDNA till vektor - sätt på sticky ends och ligera
- Transformera bakterier och jäst
Hur konstruerar man ett genomiskt bibliotek?
- Extrahera och rena kromosomalt DNA
- Klyv DNA med restriktionsnukleaser
- DNA-fragmenten sätts in i plasmider mha ligas
Vektorn sätts in i bakterier eller jäst
Hur kan man identifiera en klon för en specifik gen i biblioteket?
KOLONIHYBRIDISERING
- Överför klonerna från biblioteket till filter
- Lysera cellerna, avlägsna proteiner och denaturera DNA
- Fixera ssDNA till filtret
- Tillsätt radioaktivt inmärkt prob
- Tvätta bort ospecifikt bunden prob
- Exponera filtret mot röntgenfilm
- Hitta igen klonen i biblioteket
Vad är DNA-sekvensering?
Man bestämmer ordningen på dom fyra baserna i en DNA-sekvens
Hur används Sanger-metoden?
Man har en radioaktiv primer, DNA-polymeras och dideoxynukleotider (ddNTP). Dessa används för att bilda en komplementär ss-DNA. ss-DNA:t analyseras sedan i gelelektrofores där man kan se vilka kvävebaser man har
Hur fungerar shotgun-metoden?
- Bryt ned DNA till små slumpmässiga fragment
- Klona in varje fragment och sekvens
- Ordna och samla upp överlappande sekvenser
Hur fungerar clone contig-metoden?
- Bryt ned genomet till stora fragment och insertera i YAC/BAC
- Ordna klonerna baserat på överlappande sekvenser
- Bryt ned varje klon till små slumpmässiga fragment
- Klona och sekvensera varje fragment
- Samla upp överlappande sekvenser för varje klon
