Proteomics

Question 1

Wozu dient das Aussalzen und was ist dessen Einflussgröße?

Answer 1

Präzipitationsmethode

• Abtrennung von Protein- und Nicht-Protein-Bestandteilen
• selektive Anreicherung von Proteinen
• Aufkonzentrierung von Proteinen

Einflussgröße: Ionenstärke (Ein-/Aussalzen)

Question 2

Was gibt es für weitere Präzipitationsmethoden bzw. deren Einflussgrößen?

Answer 2

Einflussgrößen:

Ionenstärke
> Ein-/ Aussalzen

Wasseraktivität/ -verfügbarkeit
> Fällung mit organischen Lösungsmitteln

pH-Wert
> Fällung durch Säuredenaturierung (TCA)

Temperatur
> Fällung durch Hitzedenaturierung

Question 3

Mit welchen Salzen kann man aussalzen?

Answer 3

Aussalzen mit kosmotropen Salzen: Ammonium, Phosphation, Sulfation, Kaliumion, Ammoniumsulfat

–> schonende Fällung mit erhaltener Tertiärstruktur

• Oberflächenspannung erhöht sich
• Aggregation nimmt zu
• Proteinfaltung verstärkt sich
• Stabilität steigt

Question 4

Mit welchen Salzen kann man einsalzen?

Answer 4

Einsalzen mit chaotropen Salzen: Guanidiniumchlorid, Harnstoff, Thiocyanate (SCN-), Bariumsalze
–> Proteine denaturieren und präzipitieren

• Oberflächenspannung reduziert sich
• Aggregation sinkt
• Proteinfaltung reduziert sich
• Stabilität sinkt

Question 5

Was gibt es für Methoden der Präzipitation (Physikochemische Lyse)?

Answer 5

• Detergenzien (ionisch, nicht-ionisch)
• Einsalzen mit chaotropen Salzen
• Reduktionsmittel
• Protease-/Phosphatase-Inhibitoren

Question 6

Was sind chaotrope Salze?

Answer 6

• führen zur denaturierenden Fällung von Proteinen
• reduzieren die hydrophoben Wechselwirkungen durch Erhöhung der Unordnung der Wassermoleküle zueinander
• erhöhen die Löslichkeit von hydrophoben Molekülen im Wasser
• irgendwann denaturieren die Proteine und fallen aus
• mit chaotropen Salzen salzt man ein
• Beispiele: Guanidium(chlorid), Thiocyanate, Bariumsalze

Question 7

Was sind kosmotrope Salze?

Answer 7

• führen zur schonenden Ausfällung von Proteinen durch Entzug der Hydrathülle
• verstärken die hydrophoben Kräfte in wässrigen Proteinlösungen
• fördern Proteinaggregationen über hydrophobe Wechselwirkungen
• Proteine fallen aus unter Erhaltung der Tertiärstruktur
• schonende Fällung
• “Aussalzen”
• Beispiele: Ammonium, Kaliumion, Phosphation, Sulfation, Ammoniumsulfat

Question 8

Einbuchstabencode der Aminosäuren

Answer 8

A - Alanin (Ala)
R - Arginin (Arg)
N - Asparagin (Asn)
D - Asparaginsäure (Asp)
C - Cystein (Cys)
Q - Glutamin (Gln)
E - Glutaminsäure (Glu)
G - Glycin (Gly)
H - Histidin (His)
I - Isoleucin (Ile)
L - Leucin (Leu)
K - Lysin (Lys)
M - Methionin (Met)
F - Phenylalanin (Phe)
P - Prolin (Pro)
(U - Selenocystein (Sec))
S - Serin (Ser)
T - Threonin (Thr)
W - Tryptophan (Trp)
Y - Tyrosin (Tyr)
V - Valin (Val)

Question 9

Wofür werden TIMS-Tunnel verwendet?

Answer 9

um zB zwei gleiche AA oder AA-Reste voneinander zu trennen

Question 10

Woran kann es liegen, wenn die Ergebnisse von omics-Untersuchungen unterschiedlich sind (zB Anzahl Proteine pro Zellzyklus-Phase)? Und wie geht man dann vor?

Answer 10

-biologische Gründe
-liegt an der Probenvorbereitung
-liegt an der MS

Lösung: normalisieren, zB den Mittelwert abziehen oder durch ihn teilen (0-verteilt)

Question 11

Was ist ein Violinplot?

Answer 11

Ein boxplot, der durch die Breite die Menge der Daten zeigt

Question 12

was untersucht eine principle component analysis?

Answer 12

untersucht den Einfluss von Faktoren, die zur Heterogenität der Probe beitragen

Question 13

wofür werden in proteomics log10- und log2-Berechnungen verwendet?

Answer 13

• um zu schauen, ob sich Proteine signifikant unterscheiden
• (-)log10 (p-value) auf der y-Achse
• log2-fold difference auf der x-Achse (zB bei der Untersuchung der verschiedenen Stadien des Zellzyklus: G2-M vs. G1-S)
• log2 fold change: rechnet Behandelt durch Kontrolle. Bei den meisten Proteinen ist das Ergebnis =1 und log2(1)=0
• daher hat das Diagramm bei 0 seinen charakteristischen Peak
• Proteine, bei denen Behandlung/Kontrolle nicht 1 ist, weichen ab und werden erkennbar dargestellt

Question 14

Wo schneidet Trypsin?

Answer 14

• schneidet c-terminal von Lys und Arg, außer wenn Pro folgt
• Inaktivierung bei niedrigem pH, empfindlich gegenüber SDS/Urea
• Phosphorylierungen in der Nähe der Schnittstellen können stören

Question 15

Prinzip hinter SILAC (kurz)

Answer 15

“Stable isotope labelling with amino acids in cell culture”

beruht auf dem Einfügen von Aminosäuren, die mit stabilen Isotopen markiert wurden, in das Proteom durch Einschleusen in den Metabolismus

Question 16

wie funktioniert das SILAC labelling?

Answer 16

Zellkultur: light und heavy Platten

light: normales Medium mit natürlichem leichten Isotop
heavy: Medium, dass AA enthält, die mit stabilen schweren Isotopen markiert sind. ZB 13C im Arginin

Zellen werden kultiviert und dabei bauen sie die schweren Isotope in das Proteom ein. Prozess dauert ca. zwei Wochen.

Quantifizierungsanalyse mit LC-MS/MS: das ratio von Peptiden mit Isotopenlabel zu unmarkierten Peptiden wird gemessen.

Über die relative Abundanz kann quantifiziert werden.

Question 17

Klausur: Wann schneidet Trypsin und welchen Vorteil haben ionisierungsgeschnittene Fragmente?

Answer 17

Trypsin schneidet nach Lysin und Arginin.

Es entstehen vorwiegend einfach positiv geladen Ionen, weil diese AA protoniert einfach positiv geladen sind und somit auch das Peptid einfach positiv geladen ist.

……

Question 18

Nenne Beispiele für metabolisches und chemisches Labelling. Auf welcher Ebene werden sie quantifiziert? Wo werden die Label eingefügt? Ist das absolute oder relative Quantifizierung?

Answer 18

Metabolisches Labelling:
- SILAC: Inkubation der Probe mit Aminosäureresten, die mit schweren Isotopen markiert sind&raquo_space; Einschleusen in das Proteom durch Aufnahme in den Metabolismus
- Quantifizierung auf MS1 Ebene
- Relative Quantifizierung

Chemisches Labelling:
- Labelling mit Dimethyl: Reaktion mit primären Aminen
- iTRAQ (isobaric trags for relative and absolute quantification): Reporterion, Reaktion mit freien Aminen. Quantifizierung der Reporterionen durch Fragmentierung