Mitochondrien und andere Organelle Flashcards
Warum benötigen wir Energie?
- Transport
- Synthese, Abbau, Exkretion
- Bewegung
- Immunabwehr (bei Krankheit kommt der Körper in Insulinresistenz, damit die Immunzellen genug Zucker bekommen)
Woher stammt die Energie für den Körper?
Aus der oxidativen Phosphorylierung (welche aus dem Citratzyklus mit NADH und FADH2 gespeist wird)
Komplex I oxidiert NADH zu NAD+ + H+
Komplex II oxidiert FADH2 zu FAD
Was sind die wichtigsten mitochondrialen Funktionen?
- Energiestoffwechsel
- Ionenhomöostase (Calcium, Magnesium)
- Mitochondriale Dynamik
- Zellorganellen-Kommunikation
- Apoptose/Zellzyklus
Was passiert im Mitochondrium (Energiestoffwechsel)?
Oxidation der reduzierenden Äquivalente NADH oder FADH2 und die Phosphorylierung von ADP zu ATP, zudem Uncoupling in spezialisierten Geweben (z.B. Wärmeproduktion zum Schutz des Hirns vor dem Auskühlen)
Analyse von mitochondrialen Disruptoren:
Wie wird die mitochondriale/genomische DNA bestimmt?
Anti-HIV Medikamente
Effekt: mitochondriale DNA wird geblockt
Analyse von mitochondrialen Disruptoren:
Wie wird die mitochondriale Atmung bestimmt?
Cyanid oder Rotenon werden als Elektronentransporthemmer eingesetzt.
Analyse von mitochondrialen Disruptoren:
Wie werden ROS, Lipidperoxidation und Proteincarbonylierung bestimmt?
Paraquat oder H2O2 sind oxidative Stressinduzierer.
Analyse von mitochondrialen Disruptoren:
Wie wird Calcium gemessen?
Divalente Blei-Ionen verändern die Calcium-Ionen-Homöostase.
Analyse von mitochondrialen Disruptoren:
Was verwendet man beim Live-cell imaging und bei der Elektronenmikroskopie?
Toxische Metabolite von bspw. MPTP:
MPP+
Damit erreicht man eine mitochondriale Fragmentierung.
Was gibt es für Ansätze, um die mitochondriale Funktion zu analysieren?
- Funktionelle Analyse: Respirometer, Membranpotential
- Gen-/Proteinexpression
- Redox-Signale; ROS Formation
- Substratnutzung (bei gesunden Mitochondrien findet ein Switch der Substratnutzung beim Übergang Tag/Nacht statt. Ist bei kranken Mitochondrien gestört)
- Stressantworten
- Dynamik: Echtzeitmikroskopie
Wie kann die mitchondriale Dynamik untersucht werden?
Echtzeitmikroskopie
–> Verwendung eines Mitotracker stain
–> je dunkler die Fluoreszenz erscheint, desto höher ist das Membranpotential (Protonengradient), desto besser die mitochondriale Funktionsfähigkeit
Was gibt es für Tests, um die mitochondriale Masse zu bestimmen?
- mitochondriale Farbstoffe (unabhängig vom Membranpotential) wie Mitotracker green
Beispiel: Hsp60 (grün) und DAPI (blau) Färbung fixierter Neurone - Bestimmung von housekeeping Proteinen (Fluoreszenzanlyse und Quantifizierung des Signals):
Beispiel: WB für Untereinheiten der Elektronentransportkette - Bestimmung des mitochondrialen DNA-Gehalts in Relation zum genomischen DNA-Gehalt (qPCR)
Beachten: nicht jedes Mito hat ein Genom (durch Fusion und Fission), daher kann der DNA-Gehalt zwischen Mito und Nucleus unterschiedlich sein, daher nicht als alleinige Methode geeignet) - Ermittlung der Anzahl der Mitochondrien (Elektronenmikroskopie) (3D Struktur ist wichtig, um die Anzahl genau zu erfassen)
Was ist ein Housekeeping Gen bei Mitochondrien (Beispiel)?
Ein Protein, was immer in Mitos zu finden ist.
zB: C(I)- oder C(IV)-Protein
Was ist das Besondere der mitochondrialen Morphologie im Herzen?
Enge Matrixstruktur:
- viel ATP
- primär beta-Oxidation
Wofür ist die Mitophagie wichtig?
nicht funktionstüchtige Mitos müssen aussortiert werden, da sie sonst ihre möglicherweise defekte DNA weiter geben könnten
Wodurch wird die Mitophagie bewirkt/eingeleitet?
(Was sind die pathophysiologischen Prozesse, die zur Mitophagie führen?)
- ROS, RNS, RLS generieren Stress
- mitochondriale DNA (mtDNA) wird geschädigt
- Störung des Elektronentransfers, Reservekapazität niedriger
–> Fission
–> Mitophagie
Wie wird der Sauerstoffverbrauch gemessen?
(Physikochemisches Prinzip hinter Clark-Elektrode und Seahorse)
Mit der Clark-Elektrode
Zwei Elektroden (Platin und Silber), die von einer KCl-Elektrolytlösung umgeben sind. Sind durch eine O2-permeable Membran getrennt. Der Strom fließt von der Silber- zur Platinelektrode.
Stromfluss ist nur vom O2-Fluss abhängig.
Der Fluss der Elektronen bedingt den Strom I, welcher direkt proportional zum Partialdruck des Sauerstoffs ist, daher gilt p(O2) proportional zu I.
Reaktionskammer: beeinhaltet Zellen und Medium (zB von Leber, Muskel). Ist mit O2-permeabler Membran von der KCl/Elektrodenkammer abgegrenzt.
Auswertung: wenn viel O2 gemessen wird, verbrauchen die Zellen nicht viel O2 (und haben zB gestörte Mitos).
Wie wird die mitochondriale Funktion in Geweben gemessen? (Isolierung)
Isolierung der Mitos mittels differentieller Zentrifugation (Dichtegradient) gefolgt von Funktionsanalyse durch eine Clarkelektrode oder Seahorse Analyser
Beachte: mitochondriales Netzwerk wird durch die Methode zerstört. Einzelne Mitos brauchen weniger O2, außerdem können sie auf alle Nährstoffe (Intermediate der Glykolyse) zugreifen.
Worauf basiert die Untersuchung isolierter Mitochondrien?
Nutzung von Succinat (+ Rotenon (inhibiert CI)) in basalen Konditionen, um CII-abhängige Atmung zu untersuchen.
Verwendung von ADP ermöglicht Aktivität der ATP-Synthase.
ADP und Phosphat müssen vorhanden sein, damit der Gradient auf- und abgebaut werden kann.
Zeitraubend, wird nur gemacht, wenn eine genaue Analyse benötigt wird.
Was ist das Prinzip der JC1-Färbung?
Mitochondriales Membranpotential: Membran ist positiv geladen, Matrix negativ. Membran ist permeabel für JC1 Moleküle. Diese sind positiv geladen, daher akkumulieren sie im negativen Inneren des Mitos. Bei niedriger Konzentration liegen sie als Monomere vor und fluoreszieren grün, bei hohen Konzentrationen aggregieren/oligomerisieren sie und fluoreszieren rot. Durch die Verminderung des rot/grün ratios wird eine Depolarisation der Zelle angezeigt: Je mehr rot detektiert wird, desto höher ist das Membranpotential, desto aktiver ist das Mito. Grün bedeutet Depolarisation.
- JC-1 Farbstoff wird zum Medium hinzugegeben
- Visualisierung des Membranpotentials, kann auch zur Apoptosebestimmung genutzt werden und zur allgemeinen Lokalisation der Mitos und Bestimmung von Gesundheit und Vorkommen.
- Analyse über Fluoreszenzmikroskopie oder -bestimmung (generell: Floureszenz-imaging), oder über flow cytometry
- Quantifizierung über FACS
Seahorse Bioflux Analyser
Assay, mit dem der Sauerstoffverbrauch von Mitos gemessen wird (durch Nutzung von Fluorophoren) (in Multi-Well-Platte)
- paralleles Messen von mehreren Proben möglich
- unterschiedliche Stimulierungen in einem Experiment möglich
- Untersuchung verschiedener Nährstoffe
- Komplexe der ETC können individuell inhibiert werden
Prinzip:
Messung der oxygen consumption rate (OCR) in definierten Intervallen (Auftragung OCR (pmol/min) gegen Zeit)
- Messung der basalen Respiration
- Oligomycin inhibiert Komplex V (ATP-Synthase): durch Differenz zur basalen Respiration Bestimmung des O2-Verbrauchs möglich, der nur für die ATP-Produktion gebraucht wird
- FCCP macht Löcher in die Membran –> maximale Respiration: metabolische Flexibilität ist die Zunahme zur basalen Respiration, maximaler Verbrauch
- Rotenon inhibiert CI, Antimycin inhibiert CIII: Inhibition des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs
Durch Vergleich von Zellen, die mit Kontrolllösung (BSA) behandelt wurden, mit Zellen, die mit einer Testsubstanz (zB Palmitat) behandelt wurden, kann die Wirkung dieser Substanz auf die mitochondriale Atmung untersucht werden. (zB Fragestellung: Hat Palmitat einen lipotoxischen Effekt auf hypothalamische Neuronen?)
Was sind Konsequenzen oxidativen Stresses und was entsteht dabei?
Wie bestimmt man oxidativen Stress in Mitochondrien?
- ox. Stress ist Hauptmerkmal mitochondrialer Dysfunktion
- Konsequenzen oxidativen Stresses sind Proteinoxidierung und Lipidoxidierung
- Proteincarbonyle entstehen, können aber nicht direkt detektiert werden
Bestimmung erfolgt über Derivatisierung der Carbonylgruppen, meistens unter Verwendung von DNPH (Dinitrophenolhydrazin), sodass Proteincarbonyle per WB mittels DNPH-Antikörper detektiert werden können (SDS-Page + WB (Enzymkonjugierter sekundärer AK, ECL-Entwicklung (HRP)))
Wie entstehen Proteincarbonyle?
- direkte Oxidation von Proteinen durch ROS
- reduzierende Zucker oder deren Oxidationsprodukte reagieren mit Protein-Gruppen zu Ketoaminen, Ketoaldehyden, Deoxysonen
- Oxidative Abspaltung des Proteinrückgrats
- Oxidativer Zerfall von PUFAs führt zu Proteincarbonylen (bei Reaktion miteinander)
Welchen Einfluss haben carbonylierte Proteine auf die Zelle?
- irreversibler Verlust der Proteinfunktion
- wenn die Proteincarbonyle nicht abgebaut werden, verursacht ihre Akkumulation Zell-/Gewebeschäden
- werden die Gewebeschäden nicht besetigt und die darin enthaltenen Proteincarbonyle, stirbt die Zelle durch Nekrose oder Apoptose
Was ist Proteincarbonylierung?
- ein Typ der Proteinoxidation
- kovalente, irreversible Modifikation der Seitenkettenreste von Cys, His oder Lys durch ROS und Lipidperoxidation, wodurch Carbonylderivate resultieren
- ein Prozess, der reaktive Ketone oder Aldehyde formt, welche mit DNPH reagieren und Hydrazon bilden (Nachweis über DNPH-AK)
Prinzip hinter einer SDS-Page
- Proteine (negativ und positiv) sind gefaltet und werden durch Disulfidbrücken in ihrer Struktur gehalten
- Reduktion der Disulfid-Brücken durch 2-mercaptoethanol
- Zugabe von SDS (negativ geladen)
- SDS-Moleküle lagern sich an das Proteinrückgrat an, Proteine sind aufgefaltet (lineare Struktur)
- negative Ladung des Protein-SDS-Komplexes ist nun proportional zur Länge des Polypeptids
- Anlegung von Strom (Wanderung der Komplexe Richtung Anode)
- Auftrennung nach Molekulargewicht
Aufbau eines WB Transfers
Kathode (-)
Transferkassette
(Schwamm)
Filterpapier
Gel
PVDF-Membran
Filterpapier
(Schwamm)
Transferkassette
Anode (+)
Plus Transferpuffer
Nenne ROS-entgiftende Enzyme und die Reaktionen
Zytoplasma:
O2- –> H2O2 (SOD1, cytoplasmatic superoxide dismutase)
H2O2 –> O2 + H2O (Gpx, Cat - Glutathionperoxidase, Catalase)
Mitochondrienmatrix:
O2- –> H2O2 (SOD2, mitochondrial superoxide dismutase)
H2O2 –> O2 + H2O (GPX4, Glutathionperoxidase)
Wie bilden sich Lipidperoxide?
Superoxidradikale, die nicht von SOD1/2 zu H2O2 reagieren, interagieren mit Fettsäuren
Lipidperoxidation Schritte:
Initiation
Vermehrung
–> Kettenreaktion
Termination durch
… Entstehung von Endprodukten (Produkt zweier Radikale)
… Verbauch von Substrat ( zB PUFAs)
… Antioxidantien (Vitamine, Enzyme)
Funktionelle Konsequenzen der Lipidperoxidation
- Zerstörung der Membranfluidität
- Veränderung von Signalkaskaden (zB durch Plasmamembran oder mitochondrial membrane Lipidperoxidation)
- Formation von Addukten (z.B. mit Proteinen)
–> Cardiolipin Peroxidation (Cardiolipin stibilisiert die Mito-Membran und hält die Komplexe zusammen)
–> Membranlipidperoxidation
–> Cytochrom c Verlust
–> Veränderung der metabolischen Aktivität
–> Konsequenz: Zelltod durch Aktivierung des Fas-Rezeptors (Kaspase Kaskade)
Wie wird die Lipidperoxidation bestimmt?
Thiobarbitursäure reaktive Substanzen (TBARS) werden als Nebenprodukt der Lipidperoxidation geformt, welche durch einen TBARS (TBA) Test detektiert werden können
Prinzip:
In Gegenwart von Hitze und Säure reagiert MDA mit TBA zu einem rosafarbenen Farbstoff. Die Farbintensität zeigt die Stärke der Lipidperoxidation an.
Der TBA-Test (TBA = thiobarbituric acid):
nutzt die Reaktion von Thiobarbitursäure mit Oxidationsprodukten von Fetten, vor allem Malondialdehyd.
Es entsteht aus einem Molekül MDA mit 2 Molekülen Thiobarbitursäure ein rosafarbener Farbstoff. Quantitative Bestimmung über Photometrie.
Welche sind die drei Arme der ungefalteten Protein Antwort des ER und was sollen sie bewirken?
ATF6
PERK
IRE1
Wirkung: Reduktion des ER Stresses
Warum ist modulierbarer ER Stress (zB nach Sport) wichtig?
Durch die Antworten auf den Stress können Schutzmechanismen ausgerufen werden, die die Mitochondrien und die Zelle vor dem Zelltod schützen.
Wodurch wird ATF6 aktiviert und was bewirkt es?
Aktivierung durch: Proteolyse
Bewirkt: Antwort auf Transkriptionsebene, Erhöhung der Proteinfaltungskapazität des ER
Wodurch werden PERK und IRE1 aktiviert und was bewirkt es?
PERK Aktivierung durch: Translationskontrolle
IRE1 Aktivierung durch: unkonventionelles mRNA-Splicing
Bewirken: Translationskontrolle und mRNA-Zerfall –> Reduktion der Proteinfaltmenge für das ER
Klausurfrage: Wie entstehen ROS und wie kann man ROS analysieren?
ROS entstehen durch sauerstoffabhängige Redoxreaktionen, zum Beispiel als Nebenprodukt bei der mitochondrialen Zellatmung, durch Umweltgifte oder bei der Immunabwehr.
Sie werden durch die Superoxidismutase zu H2O2 umgesetzt, welches in einem weiteren Schritt von der Glutathionperoxidase oder Catalase zu O2 und H2O neutralisiert wird. Superoxide, die nicht von den organismuseigenen ROS-entgiftenden Enzymen umgewandelt werden, können zu Lipidperoxidation (Reaktion mit Lipiden) oder Proteincarbonylen (Reaktion mit den Seitenketten Lys, Cys, His) führen. Diese können indirekt nachgewiesen werden.
Nachweis Proteincarbonyle:
- Bestimmung über Derivatisierung der Carbonylgruppen,
- unter Verwendung von DNPH (Dinitrophenolhydrazin)
- Proteincarbonyle können dann per WB mittels DNPH-Antikörper detektiert werden (SDS-Page + WB (Enzymkonjugierter sekundärer AK, ECL-Entwicklung (HRP)))
Nachweis Lipidperoxidation:
Thiobarbitursäure reaktive Substanzen (TBARS) werden als Nebenprodukt der Lipidperoxidation geformt, welche durch einen TBARS (TBA) Test detektiert werden können
Prinzip:
In Gegenwart von Hitze und Säure reagiert MDA mit TBA zu einem rosafarbenen Farbstoff. Die Farbintensität zeigt die Stärke der Lipidperoxidation an.
Der TBA-Test (TBA = thiobarbituric acid):
nutzt die Reaktion von Thiobarbitursäure mit Oxidationsprodukten von Fetten, vor allem Malondialdehyd.
Es entsteht aus einem Molekül MDA mit 2 Molekülen Thiobarbitursäure ein rosafarbener Farbstoff. Quantitative Bestimmung über Photometrie.
