PCR Flashcards
Was ist Sanger-Sequenzierung und wie funktioniert sie?
Kettenabbruchsynthese, Methode zur Sequenzierung von DNA.
- vier gleiche Ansätze mit allen Nukleotiden, dazu in jedem Ansatz eine der Basen als modifizierte Variante: ddNTPs (Didesoxynukleosidtriphosphat), denen die 3’-Hydroxylgruppe fehlt und die deswegen einen Kettenabbruch herbeiführen (keine Verknüpfung mit dem nächsten Nukleotid), wenn sie von der Polymerase verbaut werden
- so entstehen in jedem Gefäß DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, alle enden mit dem ddNTP
- anschließend Gel-Elektrophorese, um die Fragmente ihrer Größe nach aufzutrennen
- von kurz nach lang kann somit abgelesen werden, auf welches Nukleotid das Fragment endet und so wird die Sequenz entschlüsselt
Heute:
• Auftrennung mittels Kapillarelektrophorese, Anregung zur Fluoreszenz mittels Laser –> Detektor –> Chromatogramm: direkte Wiedergabe der Sequenz des sequenzierten DNA-Stranges
Was sind die Vorteile einer Sanger-Sequenzierung?
- Vergleichbarkeit der Daten, die auf einer weitgehend standardisierten Methode beruhen
- Robustheit und Reproduzierbarkeit der Methode
- Sicherstellung der Qualität durch internationale Ringversuche
- vergleichsweise einfache Durchführbarkeit ohne aufwändige Optimierungsschritte
Wie kann man eine real-time PCR quantifizieren? Welche drei Möglichkeiten der Auswertung hat man?
• Absolute Quantifizierung
– Externe Kalibrierungskurve mittels Standards notwendig
– Nachteil: aufwendig
– Beispiel: Fragestellung: Wie hoch ist Rezeptor x im Verhältnis zum Referenzgen y in den Proben A und B exprimiert?
• Relative Quantifizierung
– Vergleich der Expression eines Gens in verschiedenen Zuständen/unter verschiedenen Bedingungen
–Beispiel Fragestellung: Wie unterscheidet sich die Sulfotransferase in Mäusen nach einer Gemüsediät im Vergleich zu Kontrollmäusen?
Auswertung:
• Standardkurve
• ∆∆Ct-Methode
• Methode nach Pfaffl (2001)
Was kommen für Komponenten in eine PCR?
• Templates = DNA aus Proben
• Primer
• DNA-Polymerasen (hitzestabil !!)
• MgCl2
• Puffersystem
• Desoxynucleotide (dNTPs: dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
Wofür wird MgCl2 in die PCR gegeben?
– Beeinflusst Primerannealing, Trennung der Stränge bei Denaturierung, Produktspezifität, Bildung von Primerdimeren, Fehlerrate, Enzymaktivität
– Optimale Konzentration: 0.5-2.5 mM
Wie muss ein Primer konstruiert sein bzw. was für Eigenschaften muss er haben?
– Maßgeschneidert
– Länge von 18-30 Nucleotiden, 40-60% G+C, Schmelztemperatur: 55-80°C; annähernd gleiche Schmelztemperaturen für forward und reverse Primer
– nicht mehr als 4 gleiche Basen nacheinander (AAAA) Vermeidung von frameshifts und Fehlhybridisierungen
– keine Bildung von internen Haarnadeln (hairpin loops) oder anderen Sekundärstrukturen
– Keine Bindung an sich selbst (Homodimere) oder an andere Primer (Heterodimere)
– Spezifisch
Klausurfrage: Wie läuft eine PCR ab?
- Denaturierung (95°C, 5 min)
- Annealing: Hybridisierung der Primer (50-65°C, 30 sec)
- Elongation: Polymerisierung (70-72°C, 1-5 min)
- Denaturierung (95°C, 5 min)
….
Denaturierung
Denaturierung bei 95°C, 5 min
• Beginnt bereits bei 70°C
• So kurz wie möglich
Annealing
• Anlagerung der Primer bei ca. 60°C
• Abhängig von verwendeten Primer
• 𝑇𝑚 = 4 𝑥 𝐴𝑛𝑧𝑎ℎ𝑙 𝐺 𝑏𝑧𝑤. 𝐶 + 2 𝑥 (𝐴𝑛𝑧𝑎ℎ𝑙 𝑇 𝑜𝑑𝑒𝑟 𝐴)
– Nur für kurze Primer (ca 20 bp)
• Gradienten-PCR: Austesten verschiedener Temperaturen
Elongation
Elongation bei 72°C
• Primerverlängerung
• Zeit abhängig von der Fragmentlänge –> Anpassung an
Produktlänge
• 75 Nucleotide/sec
– Taq: 0.5-1 min je kb Länge
– Pfu: 2 min je kb
Was ist eine RT-PCR?
Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR)
– Synthese von cDNA aus RNA cDNA = Template für PCR
– Nachweis der Transkription eines Gens in Gewebe oder Zellen, Spleißvarianten, cDNA-Synthese für Hybridisierungen
– Polymerasen mit RT-Aktivität
– Primer: Oligo-dT-Primer, Hexamere, spezifische Primer
Was gibt es für Möglichkeiten zu quantifizieren (Sichtbarmachen) bei der RTqPCR?
- Fluoreszenzmessung (SYBR green)
- FRET (Fluorescence resonance energy transfer)
Wie funktioniert die Sichtbarmachung mit SYBR green?
Was sind die Vorteile?
Was sind die Nachteile?
– SYBR® Green interkaliert in doppelsträngige DNA
– Fluoreszenz messbar erhöht
– Menge proportional zu der Menge an dsDNA
– Anregung 497 nm, Emission 520 nm
Vorteile:
– Universelle Verwendbarkeit
– Hohe Signalstärke
Nachteile:
– Optimierung der Reaktion notwendig
– Keine Unterscheidung zwischen Produkt und Artefakten
Wie funktioniert das Prinzip hinter FRET?
Fluoreszenzfarbstoffe F1 und F2 (Fluorochrome):
- F1 wird durch Licht bestimmter Wellenlänge (A1) angeregt, gibt die Energie in Form von Licht einer anderen Wellenlänge wieder ab (E1)
- bringt man F2 in räumliche Nähe zu F1, kann dieses durch E1 angeregt werden, denn dessen A2 entspricht dem Emissionsspektrum von F1
- Energie wird von F1 auf F2 übertragen, und Abstrahlung in Form von E2
- Messung von E2 (?)
- F1 = reporter
- F2 = quencher
Was gibt es für Weiterentwicklungen bzw. Varianten von FRET? Wie funktionieren diese?
- TaqMan:
• Reporter und Quencher sitzen auf gleichem, kleinen Oligonucleotid (auf 5´- und 3´- Ende);
wenn das OligoNT intakt ist (an DNA gebunden), ist die Lichtstärke bei E1 sehr niedrig
• Freisetzung des OligoNTs durch Polymerase
• Lichtproduktion steigt, Signalstärke steigt - Molecular beacons
• Weiterentwicklung von TaqMan
• OligoNT enthält Sequenzen, wodurch Haarnadelstruktur gebildet wird –> reporter
und quencher nah zusammen - Hybridization probes
• 2 OligoNT (3´-Ende mit Akzeptor, 5´-Ende mit Donor versehen)
• Binden an gleichen DNA-Strang, Abstand von 1-5 NT
• Messung von E2 (Licht nur nachweisbar, wenn beide Oligos an DNA gebunden)
Was sind Vor- und Nachteile von FRET und seinen Weiterentwicklungen?
– Sehr spezifisch, Multiplex-Analyse möglich
– Weniger sensitiv, verhältnismäßig teuer
Was gibt es für Kontrollen bei der RT-qPCR?
– Negativkontrolle (keine DNA)
• Überprüfung möglicher Kontamination der Reagenzien
– Kontrolle ohne Reverse Transkriptase
• Überprüfung, ob DNA-Kontaminationen Signale ergeben
– Positivkontrolle
• zeigt, dass Mix und Primer funktionieren
• Wichtig, wenn man zeigen will, dass ein Gen nicht exprimiert ist
Wie ist der Kurvenverlauf der RT-qPCR? Wo wird ausgewertet?
Kurvenverlauf: wie ein spiegelverkehrtes Z
Aufgetragen wird Fluoreszenz gegen Zyklen.
– Theoretisch verdoppelt sich die DNA-Menge pro Zyklus
– Gegen Ende der PCR sinkt Effizienz
– Linearen Bereich für Auswertung nutzen
Was ist der Schwellenwert = Cycle threshold (CT)?
• niedrigster messbarer positiver Wert einer QRT-PCR
• Angabe einer Zyklenanzahl
• direkte Beziehung zur Ausgangsmenge der
eingesetzten DNA = Grundlage für die Quantifizierung
• CT-Wert niedrig → eingesetzte Menge DNA groß
• CT-Wert hoch → Ausgangsmenge an DNA klein
Wofür wird die Schmelzkurve aufgenommen und was passiert dabei?
Überprüfung der Spezifität
– Im Anschluss an PCR ist Aufnahme der Schmelzkurve möglich
– Kontinuierliche Erhöhung der Temperatur (65°C auf 95°C) → Spezifische Temperatur → Denaturierung des Doppelstrangs → Freisetzung des Fluoreszenzfarbstoffes → Abnahme der Fluoreszenz
– Bei der spezifischen Schmelztemperatur eines PCR-Produkts liegen 50% als Einzel- und 50% als Doppelstrang vor
Was macht ein optimales Referenzgen (housekeeping Gen) aus?
• Gleiche Kopienanzahl in allen Proben
• Expression unabhängig vom Zelltyp und Zellzyklus
• Leichte Detektion
• Unbeeinflussbar
Was ist die Aufgabe/Funktion eines Referenzgens in der PCR?
• Interne Kontrolle
• Ausgleich unterschiedlicher RNA-Konzentrationen
• Ausgleich von Schwankungen in der Effizienz
Nenne Beispiele für Referenzgene für die PCR und was man allgemein bei der Verwendung beachten muss!
• GADPH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
• EF1α (Translation elongation factor EF1α)
• β-Actin
• UBC30 (Ubiquitin conjugating enzyme)
• PPA2 (Proteinphosphatase 2A)
• PPR (Pentatricopeptide repeat Protein)
• Tuba (α-Tubulin)
Beachten:
– Test vor jedem neuen Experiment
– Mitführen von 2-3 Referenzgenen pro Analyse für valide Daten
Wie funktioniert die Auswertung der PCR über die Standardkurve?
- aufgetragen wird CT-Wert gegen log(DNA) (eingesetzte DNA-Menge)
- es ergibt sich eine lineare, umgekehrt proportionale Beziehung
- Standardprobe muss mehrfach um 1:10 verdünnt werden
- Messung von Ziel- und Referenzgen für Erstellung der Standardgeraden
- Änderung des Zielgens ergibt sich aus:
relative Kopienanzahl behandelt /
relative Kopienanzahl Kontrolle
–> Beispiel Ergebnis: Das Zielgen ist in der behandelten Probe um den Faktor xy erhöht.
Wie funktioniert die Auswertung der PCR über die ∆∆CT-Methode? Was sind die Voraussetzungen?
– Normalisierung der Expression auf ein nicht reguliertes Referenzgen
– ∆Ct = Ct(Zielgen) – Ct(Referenzgen)
– ∆∆𝐶𝑡 = ∆𝐶𝑡𝐵𝑒ℎ𝑎𝑛𝑑𝑙𝑢𝑛𝑔 − ∆𝐶𝑡𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑙𝑒
– Relative Expression: 2^(-∆∆Ct)
Voraussetzungen:
• Referenz- und Zielgen haben gleiche Effizienz (100%)
• Minimale Korrektur durch Referenzgen
Wie funktioniert die Auswertung der PCR über die Methode nach Pfaffl?
• Berechnung unter Einbeziehung der Effizienzen (efficiency of the primer pair)
–> Effizienzen werden in ∆∆CT-Methode mit einbezogen
