Genexpression Flashcards
Was ist ein Reportergen? Beschreibe in Stichpunkten (auch Merkmale/Eigenschaften) und nenne drei Beispiele!
Gen, mit dessen Hilfe die Expression anderer Gene verfolgt werden kann.
Wichtige Merkmale/Eigenschaften:
- Enzyme/Proteine, die leicht messbar sind
- in der Zielzelle nur eine schwache oder basale Expression aufweisen
- werden in ein geeignetes Plasmid kloniert und dann in die Zielzelle transfiziert
Beispiele:
- Luciferase
- EGFP (enhanced green fluorescent protein)
- Beta-Galactosidase
- SEAP (secreted alkaline phosphatase)
- CAT (Chloramphenicol-Acetyl-Transferase)
Was ist ein Microarray?
Microarray ist eine Sammelbezeichnung für moderne
molekularbiologische Untersuchungssysteme, die die parallele Analyse von mehreren tausend Einzelnachweisen in einer geringen Menge biologischen Probenmaterials erlauben.
dienen dazu, die mRNA- und ncRNA-Menge bestimmter Gene oder rRNA bestimmter Organismen nachzuweisen.
Was ist das Prinzip hinter dem RNA-Array und von welchen Parametern ist der Erfolg abhängig?
▪ es findet eine Hybridisierung aufgrund von Basenpaarung statt
▪ DNA der betreffenden Gene (=Probes) ist in einem mikroskopischen Raster (= Array) auf einem Objektträger aufgebracht
▪ Reversible Bindung komplementärer DNA-Stränge
Abhängig von folgenden Parametern:
▪ prozentualer Gehalt der Basen Guanin und Cytosin (%GC)
▪ die Länge des DNA-Doppelstranges (n)
▪ Lösungsmittel (z.B. Formamid destabilisiert den Doppelstrang)
Grobe Arbeitsschritte RNA-Microarray
▪ Biologische Probe
▪ Isolation von Gesamt-(m)RNA
▪ Reverse Transkription (Amplifikation): cDNA
▪ In vitro Transkription (labeling): Biotin-cRNA
▪ Fragmentierung
▪ Hybridisierung
▪ Scanning
▪ Auswertung
Unterschied technische/biologische Replikate
▪ Technische Replikate sind geeignet, um methodische Variation (Hybridisierung, Belichtung usw.) zu reduzieren
▪ Biologische Replikate (mind. 3) sind unerlässlich für ein
aussagekräftiges Experiment
Was ist der fold change und was sind die Probleme dabei, was ist ein besseres Kriterium?
Mathematische Untersuchung der Stärke der Expression von zwei Genen verglichen untereinander
Rechnung:
Expressionslevel in Probe 1/Expressionslevel in Probe 2
Problem
• der fold change sagt nichts über die Varianz aus
• kleine, aber sehr konsistente Effekte können verloren gehen
besseres Kriterium: fold change und p-Wert kombinieren
(Häufig: FC > 1.5; p > 0.05 )
Wie findet man regulatorische Elemente in Promotoren?
• Phylogenetisches Screening (Vergleich der Promotoren-Sequenzen aus verschiedenen Spezies: Konservierte Bereiche sind häufig wichtige regulatorische Elemente)
• In silico: Computeranalyse (MatInspector)
Wie überprüft man die Funktionalität eines potentiellen
regulatorischen Elements?
• Reportergene und Plasmide
• Luciferase-Assays
Was gibt es für Regulationsmechanismen an Promotoren?
Aktivatoren:
binden an Enhancer-Elemente und beschleunigen die Transkriptionsrate
Repressoren:
binden an Silencer-Elemente und verlangsamen die Transkriptionsrate
Ko-Aktivatoren:
Adaptermoleküle, die die Wirkung von Aktivatoren und Repressoren vermitteln
Basale Transkriptionsfaktoren:
Positionieren die RNA-Polymerase an den Transkriptionsstart und initiieren die Transkription
Definition und Aufbau eines Promotors
Nukleotid-Sequenz auf der DNA, die die regulierte Expression eines Gens ermöglicht
- liegt am 5’-Ende und somit vor dem RNA-codierenden Bereich des Gens
- spezifische Wechselwirkung mit den Transkriptionsfaktoren (an DNA-Sequenz bindende Proteine), welche den Start der Transkription des Gens durch die RNA-Polymerase vermitteln
- TATA-Box dient als Ausgangspunkt für die Assemblierung der TFs
Was sind Plasmide?
zirkuläre, doppelsträngige DNA, die sich unabhängig vom bakteriellen Genom in Bakterien vermehren können
Was sind wichtige Komponenten eines Reportergen-Plasmids (Beispiel Luciferase-Assay)?
• multiple cloning site (Schnittstellen für Restriktionsenzyme, hier wird der gewünschte Promotor eingebaut)
• danach codierende Sequenz für Luciferase
• Selektionsgen: Resistenz gegen Ampicillin (für Bakterien)
• enthält keinen eigenen Promotor
Wie wird die Luciferaseaktivität gemessen?
Messung der Bio-Lumineszenz
• Zellextrakt, der Luciferase enthält, wird mit ATP versetzt und Luciferin wird zugegeben
• Luciferase spaltet das Substrat Luciferin in Anwesenheit von ATP zu Oxyluciferin
• Freisetzung von Photonen (Lumineszenz; innerhalb von 10 sec)
• Relative Quantifizierung (RLU = relative light units)
Was ist der RNAi Mechanismus?
RNA-Interferenz
= post-transkriptionelle Gen-Inaktivierung (gene silencing)
Biologische Regulation der mRNA-Stabilität und der Genexpression
Prozess, in dem kleine RNA-Moleküle die Genexpression oder Translation inhibieren, indem die Ziel-mRNA neutralisiert wird
Prinzipien hinter RNAi, um die Genexpression zu regulieren
Destabilisierung und Degradation spezifischer mRNA-Sequenzen oder Inhibition der Translation.
Biologische Funktionen von RNAi
- Schutz gegen Doppelstrang-RNA (aus Viren oder Transposons)
- Regulation der Genexpression
Welche Moleküle lösen RNAi aus?
Zwei Arten der sog. “kleinen” regulatorischen RNAs lösen RNAi aus:
- Small interfering RNAs (siRNA)
- Micro-RNAs (miRNA)
Was sind siRNAs?
= Small interfering RNAs
manchmal auch als Short Interfering RNA oder Silencing RNA bezeichnet, ist eine Klasse von doppelsträngigen (ds), nicht kodierenden RNA-Molekülen mit einer Länge von 20 bis 25 Basenpaaren, die innerhalb des RNA-Interferenz-Weges (RNAi) operieren.
20-24 bp große Fragmente, stammen von längeren
doppelsträngigen RNA-Molekülen
Wie kann siRNA die Genexpression beeinflussen?
- Ausgang: dsRNA oder hairpin
- ein dicer (Endo-Ribonuklease) schneidet die dsRNA in 20-24 bp lange Fragmente –> siRNA duplex
- „Passenger strand“ wird degradiert, „guide strand“ wird in RNAi eingesetzt
- Bildung des RISC-Komplexes: Ago (Argonaute-2) (Protein): Degradierung von mRNA-Species oder Inhibition der Translation
- RISC (RNA-induced silencing complex) an siRNA → Bindung mit mRNA: siRNA-mRNA-Komplex
→ silencing des Gens durch Teilung der mRNA
Was sind die häufigsten RISC-Komponenten der siRNA?
RISC-loading complex besteht aus Dicer, Ago2, TRBP und bindet an die dsRNA
TRBP: Reguliert DICER durch Steigerung der Nuklease-Aktivität, kann mit PACT interagieren, welches DICER inhibiert
Ago2 (Argonaute-2): Hauptform verschiedener argonaute Proteine; Holt den guide ssRNA-Strang und ermöglicht Interaktion mit komplementärer Ziel-mRNA-Sequenz;
→ schneidet Ziel-mRNA
Was sind miRNAs?
MicroRNA
ähneln den kleinen interferierenden RNAs (siRNAs), außer
dass miRNAs von Regionen von RNA-Transkripten (codiert in spezifischen Genen) abstammen, die sich auf sich selbst
hybridisieren, um kurze „Haarnadeln“ zu bilden. Das menschliche Genom kann über 1000 miRNAs kodieren.
Expression und Prozessierung von pri-pre-miRNAs als kleine RNA-Moleküle, die sich in sich selbst zurückfalten, um Haarnadelstrukturen zu bilden
Wie funktioniert die RNAi durch miRNAs?
- pre-miRNA wird synthetisiert (microRNA-Gen im Zellkern)
- pre-miRNA hybridisiert zu Haarnadel (–> dsRNA)
- Bindung micro-processor Komplex und Ausscheidung aus dem ZK
- Bindung von RISC und Ago2 an den miRNA-Doppelstrang
- Spaltung in passenger und guide Stränge, letzterer bindet an mRNA
→ Protein-Translation wird inhibiert und die mRNA destabilisiert
Wie können siRNAs im Labor angewandt werden?
Anwendung von siRNA Pools
= simultane Transfektion von mehreren siRNAs das spezifisch ein bestimmtes Gen bzw. eine mRNA-Sequenz inaktivieren
Können von kommerziellen Anbietern für die meisten Gene gekauft werden
Vorteile:
▪ Einfach und schnell
▪ Validierte siRNA-Pools sind für die meisten Mensch/Maus/Ratte-Gene verfügbar
Nachteile:
▪ Knockdown ist nur transient (1-5 Tage)
▪ Starke Abhängigkeit von der Effizienz der Transfektion in die Zielzelle, keine Seleketion
Kontrollen für siRNA Experimente:
❖ Unspezifische siRNA: Bindet an keine bekannten mRNAs (mindestens 4 Mismatches)
❖ ABER: Partielle Komplementarität kann bereits zum Knockdown führen
❖ scramble siRNA = siRNA-Sequenz enthält die gleichen Nukleotide wie die Ziel-siRNAs, jedoch in einer randomisierten Sequenz
Was ist shRNA?
Ektopisch exprimierte siRNA aus exogenen Quellen (zB virale Expression) (Experimentator)
Vektor → Transkription → shRNA → Teilung durch Dicer → siRNA
Verwendung einer Antibiotika-Resistenz als Selektionsmarker
