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Aktuelle Themen der ernährungswissenschaftlichen Forschung > Genexpression > Flashcards

Genexpression Flashcards

1
Q

Was ist ein Reportergen? Beschreibe in Stichpunkten (auch Merkmale/Eigenschaften) und nenne drei Beispiele!

A

Gen, mit dessen Hilfe die Expression anderer Gene verfolgt werden kann.

Wichtige Merkmale/Eigenschaften:
- Enzyme/Proteine, die leicht messbar sind
- in der Zielzelle nur eine schwache oder basale Expression aufweisen
- werden in ein geeignetes Plasmid kloniert und dann in die Zielzelle transfiziert

Beispiele:
- Luciferase
- EGFP (enhanced green fluorescent protein)
- Beta-Galactosidase
- SEAP (secreted alkaline phosphatase)
- CAT (Chloramphenicol-Acetyl-Transferase)

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2
Q

Was ist ein Microarray?

A

Microarray ist eine Sammelbezeichnung für moderne
molekularbiologische Untersuchungssysteme, die die parallele Analyse von mehreren tausend Einzelnachweisen in einer geringen Menge biologischen Probenmaterials erlauben.

dienen dazu, die mRNA- und ncRNA-Menge bestimmter Gene oder rRNA bestimmter Organismen nachzuweisen.

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3
Q

Was ist das Prinzip hinter dem RNA-Array und von welchen Parametern ist der Erfolg abhängig?

A

▪ es findet eine Hybridisierung aufgrund von Basenpaarung statt
▪ DNA der betreffenden Gene (=Probes) ist in einem mikroskopischen Raster (= Array) auf einem Objektträger aufgebracht
▪ Reversible Bindung komplementärer DNA-Stränge

Abhängig von folgenden Parametern:
▪ prozentualer Gehalt der Basen Guanin und Cytosin (%GC)
▪ die Länge des DNA-Doppelstranges (n)
▪ Lösungsmittel (z.B. Formamid destabilisiert den Doppelstrang)

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4
Q

Grobe Arbeitsschritte RNA-Microarray

A

▪ Biologische Probe
▪ Isolation von Gesamt-(m)RNA
▪ Reverse Transkription (Amplifikation): cDNA
▪ In vitro Transkription (labeling): Biotin-cRNA
▪ Fragmentierung
▪ Hybridisierung
▪ Scanning
▪ Auswertung

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5
Q

Unterschied technische/biologische Replikate

A

▪ Technische Replikate sind geeignet, um methodische Variation (Hybridisierung, Belichtung usw.) zu reduzieren

▪ Biologische Replikate (mind. 3) sind unerlässlich für ein
aussagekräftiges Experiment

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6
Q

Was ist der fold change und was sind die Probleme dabei, was ist ein besseres Kriterium?

A

Mathematische Untersuchung der Stärke der Expression von zwei Genen verglichen untereinander

Rechnung:
Expressionslevel in Probe 1/Expressionslevel in Probe 2

Problem
• der fold change sagt nichts über die Varianz aus
• kleine, aber sehr konsistente Effekte können verloren gehen

besseres Kriterium: fold change und p-Wert kombinieren
(Häufig: FC > 1.5; p > 0.05 )

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7
Q

Wie findet man regulatorische Elemente in Promotoren?

A

• Phylogenetisches Screening (Vergleich der Promotoren-Sequenzen aus verschiedenen Spezies: Konservierte Bereiche sind häufig wichtige regulatorische Elemente)

• In silico: Computeranalyse (MatInspector)

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8
Q

Wie überprüft man die Funktionalität eines potentiellen
regulatorischen Elements?

A

• Reportergene und Plasmide
• Luciferase-Assays

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9
Q

Was gibt es für Regulationsmechanismen an Promotoren?

A

Aktivatoren:
binden an Enhancer-Elemente und beschleunigen die Transkriptionsrate

Repressoren:
binden an Silencer-Elemente und verlangsamen die Transkriptionsrate

Ko-Aktivatoren:
Adaptermoleküle, die die Wirkung von Aktivatoren und Repressoren vermitteln

Basale Transkriptionsfaktoren:
Positionieren die RNA-Polymerase an den Transkriptionsstart und initiieren die Transkription

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10
Q

Definition und Aufbau eines Promotors

A

Nukleotid-Sequenz auf der DNA, die die regulierte Expression eines Gens ermöglicht

  • liegt am 5’-Ende und somit vor dem RNA-codierenden Bereich des Gens
  • spezifische Wechselwirkung mit den Transkriptionsfaktoren (an DNA-Sequenz bindende Proteine), welche den Start der Transkription des Gens durch die RNA-Polymerase vermitteln
  • TATA-Box dient als Ausgangspunkt für die Assemblierung der TFs
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11
Q

Was sind Plasmide?

A

zirkuläre, doppelsträngige DNA, die sich unabhängig vom bakteriellen Genom in Bakterien vermehren können

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12
Q

Was sind wichtige Komponenten eines Reportergen-Plasmids (Beispiel Luciferase-Assay)?

A

• multiple cloning site (Schnittstellen für Restriktionsenzyme, hier wird der gewünschte Promotor eingebaut)
• danach codierende Sequenz für Luciferase
• Selektionsgen: Resistenz gegen Ampicillin (für Bakterien)
• enthält keinen eigenen Promotor

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13
Q

Wie wird die Luciferaseaktivität gemessen?

A

Messung der Bio-Lumineszenz
• Zellextrakt, der Luciferase enthält, wird mit ATP versetzt und Luciferin wird zugegeben
• Luciferase spaltet das Substrat Luciferin in Anwesenheit von ATP zu Oxyluciferin
• Freisetzung von Photonen (Lumineszenz; innerhalb von 10 sec)
• Relative Quantifizierung (RLU = relative light units)

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14
Q

Was ist der RNAi Mechanismus?

A

RNA-Interferenz
= post-transkriptionelle Gen-Inaktivierung (gene silencing)

Biologische Regulation der mRNA-Stabilität und der Genexpression

Prozess, in dem kleine RNA-Moleküle die Genexpression oder Translation inhibieren, indem die Ziel-mRNA neutralisiert wird

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15
Q

Prinzipien hinter RNAi, um die Genexpression zu regulieren

A

Destabilisierung und Degradation spezifischer mRNA-Sequenzen oder Inhibition der Translation.

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16
Q

Biologische Funktionen von RNAi

A
  • Schutz gegen Doppelstrang-RNA (aus Viren oder Transposons)
  • Regulation der Genexpression
17
Q

Welche Moleküle lösen RNAi aus?

A

Zwei Arten der sog. “kleinen” regulatorischen RNAs lösen RNAi aus:

  1. Small interfering RNAs (siRNA)
  2. Micro-RNAs (miRNA)
18
Q

Was sind siRNAs?

A

= Small interfering RNAs

manchmal auch als Short Interfering RNA oder Silencing RNA bezeichnet, ist eine Klasse von doppelsträngigen (ds), nicht kodierenden RNA-Molekülen mit einer Länge von 20 bis 25 Basenpaaren, die innerhalb des RNA-Interferenz-Weges (RNAi) operieren.

20-24 bp große Fragmente, stammen von längeren
doppelsträngigen RNA-Molekülen

19
Q

Wie kann siRNA die Genexpression beeinflussen?

A
  • Ausgang: dsRNA oder hairpin
  • ein dicer (Endo-Ribonuklease) schneidet die dsRNA in 20-24 bp lange Fragmente –> siRNA duplex
  • „Passenger strand“ wird degradiert, „guide strand“ wird in RNAi eingesetzt
  • Bildung des RISC-Komplexes: Ago (Argonaute-2) (Protein): Degradierung von mRNA-Species oder Inhibition der Translation
  • RISC (RNA-induced silencing complex) an siRNA → Bindung mit mRNA: siRNA-mRNA-Komplex
    → silencing des Gens durch Teilung der mRNA
20
Q

Was sind die häufigsten RISC-Komponenten der siRNA?

A

RISC-loading complex besteht aus Dicer, Ago2, TRBP und bindet an die dsRNA

TRBP: Reguliert DICER durch Steigerung der Nuklease-Aktivität, kann mit PACT interagieren, welches DICER inhibiert

Ago2 (Argonaute-2): Hauptform verschiedener argonaute Proteine; Holt den guide ssRNA-Strang und ermöglicht Interaktion mit komplementärer Ziel-mRNA-Sequenz;
→ schneidet Ziel-mRNA

21
Q

Was sind miRNAs?

A

MicroRNA

ähneln den kleinen interferierenden RNAs (siRNAs), außer
dass miRNAs von Regionen von RNA-Transkripten (codiert in spezifischen Genen) abstammen, die sich auf sich selbst
hybridisieren, um kurze „Haarnadeln“ zu bilden. Das menschliche Genom kann über 1000 miRNAs kodieren.

Expression und Prozessierung von pri-pre-miRNAs als kleine RNA-Moleküle, die sich in sich selbst zurückfalten, um Haarnadelstrukturen zu bilden

22
Q

Wie funktioniert die RNAi durch miRNAs?

A
  • pre-miRNA wird synthetisiert (microRNA-Gen im Zellkern)
  • pre-miRNA hybridisiert zu Haarnadel (–> dsRNA)
  • Bindung micro-processor Komplex und Ausscheidung aus dem ZK
  • Bindung von RISC und Ago2 an den miRNA-Doppelstrang
  • Spaltung in passenger und guide Stränge, letzterer bindet an mRNA

→ Protein-Translation wird inhibiert und die mRNA destabilisiert

23
Q

Wie können siRNAs im Labor angewandt werden?

A

Anwendung von siRNA Pools
= simultane Transfektion von mehreren siRNAs das spezifisch ein bestimmtes Gen bzw. eine mRNA-Sequenz inaktivieren

Können von kommerziellen Anbietern für die meisten Gene gekauft werden

Vorteile:
▪ Einfach und schnell
▪ Validierte siRNA-Pools sind für die meisten Mensch/Maus/Ratte-Gene verfügbar

Nachteile:
▪ Knockdown ist nur transient (1-5 Tage)
▪ Starke Abhängigkeit von der Effizienz der Transfektion in die Zielzelle, keine Seleketion

Kontrollen für siRNA Experimente:
❖ Unspezifische siRNA: Bindet an keine bekannten mRNAs (mindestens 4 Mismatches)
❖ ABER: Partielle Komplementarität kann bereits zum Knockdown führen
❖ scramble siRNA = siRNA-Sequenz enthält die gleichen Nukleotide wie die Ziel-siRNAs, jedoch in einer randomisierten Sequenz

24
Q

Was ist shRNA?

A

Ektopisch exprimierte siRNA aus exogenen Quellen (zB virale Expression) (Experimentator)

Vektor → Transkription → shRNA → Teilung durch Dicer → siRNA

Verwendung einer Antibiotika-Resistenz als Selektionsmarker

Aktuelle Themen der ernährungswissenschaftlichen Forschung (10 decks)

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