Durchflusszytometrie Flashcards
Unterschiede zwischen embryonalen und adulten Stammzellen
Embryonale Stammzellen
✓ Totipotenz (Fähigkeit der Zellen einen kompletten Organismus zu bilden, wenn sie sich in einer Gebärmutter befinden)
✓ Pluripotenz (Zellen können zu jedem Zelltyp differenzieren, sind auf noch kein Gewebe festgelegt)
✓ Ethische Bedenken
✓ Quellen: Embryo, z.T. auch aus Nabelschnur(Blut)
Adulte Stammzellen
✓ Terminal differenzierte Gewebe enthalten adulte Stammzellen
✓ Multipotenz/ Oligopotenz (können sich zu verschiedenen Zelltypen einer bestimmten Linie entwickeln, sind aber nicht mehr in der Lage, sich zu nahezu jeder Körperzelle zu entwickeln)
✓ Nicht teilungsaktiv
✓ Quellen: Fettgewebe, Knochenmark, Blut
Unterschiede Stammzelle und Vorläuferzellen (progenitor und precursor cell)
Stammzelle
✓ Selbst-Erneuerung (Self-renewal): Obligate asymmetrische Teilung
✓ Unbegrenzte Teilungsfähigkeit
✓ Pluripotenz/ Multipotenz (vs. Totipotenz)
Vorläuferzelle (Progenitor cell)
✓ Unilaterale Differenzierungskapazität (‘committed’)
✓ Limitierte Teilungsfähigkeit
Vorläuferzelle (Precursor cell)
✓ Synonym für unilateral festgelegte (unipotente) Vorläuferzelle
✓ Kein Proliferationspotential, manchmal auch als Vorstufe der terminalen Differenzierung definiert
(z.B. Prä-Adipozyt)
Wie funktioniert die Durchflusszytometrie (allgemein, kurz)?
- Zellsuspension, um einen kontinuierlichen Strom einzelner Zellen zu erzeugen (“Einzelzellstrom”)
- Strom von Zellen passiert Laserstrahl
- Emittiertes Licht erlaubt Identifizierung von gebundenen Antikörpern und das “gating” von distinkten Zellpopulationen
- Eine elektrische Ladung wird auf der Oberfläche der Zelltropfen angebracht und erlaubt Ableitung im elektromagnet. Feld in Auffangkammern
Was ist die Gating strategy?
Durchflusscytometrie
Selection of
(a) Intact (keine PI-Aufnahme)
(b) Alive (Calcein)
(c) Single cells (AK gegen Oberflächenmarker, Fluoreszenz-Farbstoff)
from complex suspensions
Selection of homogenous cells by defined surface markers
Zu den AK-markierten Zellen werden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe hinzugegeben wie Lin-FITC (grün) oder Sca1-APC (blau), um die Zellen zu trennen.
Was ist das Detektionsprinzip beim FACS?
Anregung der Oberflächenmarker mit emittiertem Licht. Der Laser regt bei 488 nm an und der Antikörper emittiert bei 575 nm.
Wie wird die Antikörperfärbung durchgeführt?
Durchflusscytometrie
- Antikörperlösung wird zu einer Zellsuspension gegeben (definierte Zellzahl und Verdünnung des AK; z.B. 1:100 bis 1:200 ist üblich). Zellarttypische Oberflächenmoleküle werden AK-markiert.
- Inkubation auf Eis (2-3min) und im Dunkeln
- Waschen
- Filtrieren
- Zugabe von tot/lebend-Färbung (Propidium-Iodid und Calcein)
Wofür wird Propidium-Iodid bei der AK-Färbung hinzugegeben?
Durchflusscytometrie
Um tote Zellen zu färben. Nur tote Zellen nehmen den Stoff auf, denn er diffundiert passiv über defekte Membranen.
Wofür wird Calcein-blau bei der AK-Färbung hinzugegeben?
Durchflusscytometrie
Um lebende Zellen zu färben. Nur lebende Zellen nehmen den Stoff auf (Akkumulation).
Wie kann man viable cells erkennen?
Durchflusscytometrie
I. Cells that take up PI are dead:
PI only passively enters cells
with broken membranes
II. Cell that accumulate Calcein
(or similar compounds) are
alive, they actively take up
these compounds
Was zeigt der FACS scatter plot?
y-Achse: SSC – Side scatter: Granularity/complexity
x-Achse: FSC – Forward scatter: Cell size
Nenne ein paar Oberflächenmarker!
Durchflusscytometrie
CD11b/CD45 – Hematopoietic cell surface markers
CD31 – Endothelial cell surface marker
Sca1 – Progenitor cell surface marker
Lin – CD11b/CD45/CD31-negative
Wofür ist die Oberflächenmarker-Markierung?
Durchflusscytometrie
wenn man die Zellen nicht nach Größe und Komplexität trennen kann (homologe Zellen)
Was ist der Unterschied zwischen Satellite cells und FAPs?
Satellite cells = muscle stem cell
• quiescent myogenic stem cells
• in response to injury the major source of regenerating
myofibers
FAPs (fibro-adipogenic progenitors)
• Regulatory cells
• Non-myogenic
• Pathology: Give rise to intramuscular adipocytes
