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Aktuelle Themen der ernährungswissenschaftlichen Forschung > Mikroskopie > Flashcards

Mikroskopie Flashcards

1
Q

Wie funktioniert HE-Färbung? Welche Komponenten werden angefärbt und warum?

A

Hämatoxilin-Eosin-Färbung
Nutzung der Reaktionsfähigkeit bestimmter Gewebestrukturen auf bestimmte Farbstoffe. Klassifikation von Zellstrukturen und Gewebe anhand des Färbeverhaltens.

Hämatoxilin (Base) färbt saure (basophile) Komponenten der Zelle blau/bläulich
* vor allem DNA/RNA&raquo_space; Kern
* Regionen des Zytoplasmas mit vielen Ribosomen

Eosin (Säure) färbt basische (acidophile/eosinophile) Komponenten der Zelle rosa
* v.a. Bestandteile des Zytoplasmas

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2
Q

Worauf (Prinzip) basieren die Färbungen in der Histo?

A

Nutzung der Reaktionsfähigkeit bestimmter Gewebestrukturen auf bestimmte Farbstoffe. Klassifikation von Zellstrukturen und Gewebe anhand des Färbeverhaltens.

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3
Q

Welche Strukturen werden in der Histo wie angefärbt? Nenne auch Beispiele für Färbemittel.

A
  • Basophile Strukturen: enthalten Säuregruppen > Färbung mit basischen Farbstoffen (Hämatoxylin, Methylenblau, Toluidinblau)&raquo_space; DNA/RNA, Ribosome
  • Azidophile Strukturen: basische Strukturen > Färbung mit sauren Farbstoffen (Eosin, Anilinblau, Pikrinsäure)&raquo_space; Zytoplasma, kollagene Fasern
  • Neutrophile Strukturen: Färbung weder durch basische noch durch saure Farbstoffe (z.B. lipophile Bestandteile)
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4
Q

Was für Lösungen (Eigenschaft) verwendet man beim Färben in der Histo?

A

Zum Färben werden in der Regel wässrige Lösungen eingesetzt > Ersatz des zum Einbetten/Schneiden verwendeten Paraffins durch Wasser

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5
Q

Auflösung: Definition und Formel

A

Unterscheidbarkeit feiner Strukturen → geringster noch wahrnehmbarer Abstand zweier Punkte

Formel: d = lambda / n x sin(a)

d: kleinstmöglicher detektierbarer Abstand
lambda: Wellenlänge des Lichts
n: Brechungsindex des Mediums
alpha: halber Öffnungswinkel des Objektivs

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6
Q

Was sind die Auflösungsgrenzen für
- menschliches Auge
- Lichtmikroskop
- EM?

A
  • menschliches Auge ~ 200 μm (0,2 mm)
  • Lichtmikroskop ~ 0,2 μm (Immersionsöl)
  • Transmissions-Elektronenmikroskop ~ 0,1 nm (0,0001 μm) in Gewebeschnitten
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7
Q

Was ist die numerische Apertur?
Wie lautet die Formel?

A

Lichaufnahmekapazität eines Objektivs. Die numerische Apertur (NA) eines Objektives oder eines anderen optischen Elementes beschreibt dessen Lichtstärke und Auflösungsvermögen.

Je höher der Wert, umso
- höhere Auflösung
- mehr Licht für Fluoreszenzanwendung - geringere Schärfentiefe
- geringerer Arbeitsabstand
- höherer Preis

Formel:
NA = n x sin(a)

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8
Q

Wofür ist Immersionsöl wichtig?

A

Immersionsobjektive: Immersionsöl zwischen Deckglas und Objektiv (etwa gleichen Brechungsindex wie Glas):

→ Reduktion der Lichtbrechung
→ auch flachere Lichtstrahlen gelangen noch ins Objektiv
→ höhere aufgenommene “Lichtmenge” und damit auch das Auflösungsvermögen stark erhöht gegenüber Trockenobjektiven

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9
Q

Prinzip der Hellfeldmikroskopie

Lichtmikroskopie

A

Hellfeld:
- Präparat absorbiert Licht, dadurch Kontrasterzeugung (Änderung der Amplitude)
- nativ nur schwache Kontraste erkennbar (blass): daher anfärben

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10
Q

Prinzip der Dunkelfeldmikroskopie

Lichtmikroskopie

A

Dunkelfeld:
- Lichtbrechung an Phasengrenzen (Grenzen zwischen unterschiedlich dichten Strukturen) → Licht ändert Richtung
- Lichtdichte Scheibe verhindert, dass Licht vom Kondensor direkt in das Objektiv gelangt. → kein Praparat im Lichtstrahl → einheitlich schwarzes Bild
- Durch Lichtbrechung an Phasengrenzen innerhalb des Präparates ändern die Lichtstrahlen ihre Richtung und
treffen ins Objektiv → helle Strukturen auf schwarzem Hintergrund

Hauptanwendungsgebiete der Dunkelfeld-Lichtmikroskopie:
Limnologie, Mikrobiologie, Naturheilkunde

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11
Q

Prinzip der Phasenkontrastmikroskopie

Lichtmikroskopie

A

unsichtbare Phasenverschiebungen werden in Helligkeitsunterschiede (Amplitude) umgewandelt&raquo_space; Interferenz von gebeugtem Licht aus dem Präparat und dem direkten Mikroskopierlicht

  • detaillierte und konstrastreiche Darstellung transparenter Objekte
  • Präparatstrukturen: dunkel auf schwachhellem Hintergrund
  • etwas kontrastreicher als Hellfeld

wichtigstes optisches Kontrastverfahren, rel. günstig, leicht einzustellen

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12
Q

Prinzip der Polarisationsmikroskopie

Lichtmikroskopie

A

Lichtmikroskop, das polarisiertes Licht (Wellen schwingen alle in der gleichen Ebene) zur Abbildung verwendet. Es wird zur Untersuchung doppelbrechender Objekte eingesetzt.

(doppelbrechende Strukturen: regelmäßig angeordnete Einheiten (Moleküle, Atome) → meistens Kristalle, aber auch biologische Strukturen z.B. Kollagen)

Unpolarisiertes Licht gelangt durch einen Polarisator, danach trifft nur polarisiertes Licht auf die Probe. Licht gelangt dann zum Analysator, wenn die Probe die Eigenschaft der Doppelbrechung besitzt (Lichtbündel in zwei senkrecht zueinander polarisierte Teilbündel zu trennen (ordentlicher und außerordentlicher Strahl)).

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13
Q

Welche Strukturen werden mit der Polarisationsmikroskopie sichtbar gemacht?

Lichtmikroskopie

A

Kollagen Fasern > sichtbar (rot/gelb)

Elastische Fasern, Kerne > keine orientierten makromolekularen Strukturen – nicht sichtbar

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14
Q

Prinzip der Fluoreszenzmikroskopie

Fluoreszenzmikroskopie

A

Kontrasterzeugung durch Fluoreszenz

  • Beleuchtung des Präparates mit Licht einer bestimmten Wellenlänge, die von einem Fluorophor oder Fluoreszenzfarbstoff absorbiert wird
  • Übergang in einen höheren Energiezustand
  • beim Zurückfall auf den Grundzustand emittiert der Fluorophor Licht einer längeren Wellenlänge

(Absorption: „kurzwellig“, Emission: „langwellig“)

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15
Q

Welche Fluoreszenzmarker werden in der Fluoreszenzmikroskopie verwendet?

Fluoreszenzmikroskopie

A

Immunologische Färbung (Immunofluoreszenz):
* Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) → gelbgrün
* Indocarbocyanin (Cy3) → rot

Nicht-immunologische Färbung:
* 4 ́,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)→ Kernfärbung

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16
Q

Was ist die konfokale Mikroskopie?

A

Weiterentwickelte Fluoreszenzmikroskopie, bei der Auflösung und Kontrast erhöht werden durch Einsatz von zwei “konjugierten” Lochblenden.

  • normale FM: großer Lichtstrahl → Streulicht reduziert Kontrast im Bild
  • KM: Vermeidung von Streulicht → scharfe, detaillreiche Abbildung
  • Erste Blende: Reduktion der Intensität des Anregungslichts ausserhallb der Fokusebene
  • Zweite Blende: blockiert Fluoreszenzsignale aus nicht fokussierten Bereichen
17
Q

Wie werden Wellenlängen und Fokussierung bei der konfokalen Mikroskopie eingesetzt?

Was passiert bei der KM?

A
  • Fluoreszenzanregung durch Laser verschiedener Wellenlängen
  • Laserlicht wird in das Präparat fokussiert und mittels Scanner darüber geführt
  • Fluoreszenzlicht wird durch einen lichtempfindlichen Sensor hinter der konfokalen Lochblende detektiert → punktförmige Abtastung des Präparates
  • Das Fluoreszenzbild wird entsprechend zeilenweise Computer-gestützt zusammengesetzt
18
Q

Was sind Vor- und Nachteile der Elektronenmikroskopie?

A

Vorteile
- Auflösung makromolekularer Strukturen
- Darstellung feinstruktureller Zusammenhänge

Nachteile
- Teuer
- Platzbedarf
- Zusatzgeräte
- aufwändige Präparation (z.B. Bedampfung, Kontrastierung)

19
Q

Wie funktioniert die Elektronenmikroskopie?

A
  • anstelle von Licht werden Elektronen zur Abbildung verwendet
  • höheres Auflösungsvermögen, denn Wellenlänge eines Elektrons kann bis zu 100.000-mal kürzer als die des sichtbaren Lichts sein

Prinzip:
* im Vakuum wird eine Spannung an Elektrode angelegt
* Elektronen wandern von Kathode zu Anode, werden dabei beschleunigt (Elektronenstrahl)
* elektromagnetische Fokussierung in einer Kondensorlinse (Aperturblende)
* Bestrahlen des Präparats
* Bündeln des Elektronenstrahls durch Objektivlinse (elektromagnetisch)
* im Vakuum: Absorptionsreduktion der Elektronen durch Gasmoleküle!

20
Q

Mit welchen Elementen wird der Elektronenstrahl in der EM erzeugt?

A

Erzeugen des Elektronenstrahls durch Elektronenstrahlquelle (Kathode)
- Wolfram
- Lanthanhexaborit-Kristall
- Feldemission
- Schottky-Feldemission

21
Q

Unterschied zwischen Transmissionselektronenmikroskop und Rasterelektronenmiskroskop

A

Transmissionselektronenmikroskop
* Kontrastentstehung: elastisch und unelastisch gestreute Elektronen
* ungehinderter Durchtritt durch Probe
* Objektivapertur-Blende: vor allem nicht gestreute und unelastisch gestreute Elektronen können passieren → Kontraststeigerung

Rasterelektronenmiskroskop
* Prinzip: ~ Auflichtmikroskop
- zeilenförmiges „Rastern“ des Elektronenstrahls über kompakte Probe
- bildgebende Signale: Sekundärelektronen und Rückstreuelektronen

22
Q

Elastische und unelastische Streuung EM

A
  • Elastische Streuung: Strahlelektronen durch einen positiv geladenen Kern abgelenkt, wenig bis kein Energieverlust
  • Unelastische Streuung: Strahlelektronen treffen auf Elektronen in Kernhülle → Energieverlust aber geringe Abweichung aus der Bahn
23
Q

Anwendung Raster-EM

A
  • Abbildung von Oberflächen
  • Materialwissenschaft
  • Untersuchung von Oberflächenstrukturen und Zusammensetzung dieser Oberflächen
24
Q

Erkläre das Prinzip eines mikroskopischen Verfahrens und erläutere, wie der Kontrast erzeugt wird.
Für welche Anwendung ist dieses Verfahren besonders gut geeignet?

Klausurfrage

A

Dunkelfeld:
* Lichtdichte Scheibe verhindert, dass Licht vom Kondensor direkt in das Objektiv gelangt. → kein Präparat im Lichtstrahl → einheitlich schwarzes Bild

  • Beim Einlegen eines Präparates kommt es zur Lichtbrechung an den Phasengrenzen innerhalb des Präparates (Grenzen zwischen unterschiedlich dichten Strukturen)
  • → die Lichtstrahlen ändern ihre Richtung und treffen ins Objektiv
  • man sieht: → helle Strukturen auf schwarzem Hintergrund

Hauptanwendungsgebiete der Dunkelfeld-Lichtmikroskopie:
Limnologie, Mikrobiologie, Naturheilkunde

25
Q

Wie sollte ein histologisches Präparat sein und was für Probleme gibt es oft bei der Aufarbeitung?

Histologische Präparate

A

Präparat sollte die gleiche Struktur und molekulare Zusammensetzung wie in vivo aufweisen&raquo_space; selten möglich

Durch den Prozess der Probenvorbereitung kommt es in der Regel zu
* Artefakten
* Deformation
* Verlust von Komponenten

26
Q

Stufen der Aufarbeitung der histologischen Proben für die Lichtmikroskopie

Herstellung histologischer Schnitte

Histologische Präparate

A
  • Probenentnahme
  • Fixierung
  • Dehydrierung
  • Immersion in Intermedium
  • Einbettung
  • Schneiden, Aufziehen, Färben
27
Q

Wofür wird die Fixierung durchgeführt?

Histologische Präparate

A
  • stopt zellulären Metabolismus
  • verhindert Autolyse (Degradation von Geweben durch enzymatische Aktivität)
  • tötet Mikroorganismen (stopt mikrobielle Gewebelyse)
  • härtenden Effekt auf Gewebe
28
Q

Was ist bei einem Fixiermittel wichtig?

Histologische Präparate

A

Bedarf:
- schnelles Eindringen von Fixiermittel in die Gewebe
- Erhalt der Struktur
- Beibehaltung der Affinität für Farbstoffe (Anfärbbarkeit)
- Aufrechterhaltung der Antigenstruktur von Proteinen

29
Q

Was sind die Probleme beim Präsentieren von autolytischem Gewebe?

Histologische Präparate

A
  1. „Verwaschenes“ Aussehen mit Schwellung des Zytoplasmas bis zu Formierung einer granulierten homogenen Masse, die sich schlecht anfärben lässt
  2. Die Kerne autolytischer Zellen zeigen Veränderungen die sich auch im Rahmen der Nekrose finden, einschließlich Kondensation (Pyknose), Fragmentierung (Karyorrhexis) und Lyse (Karyolyse)
  3. Epithelien können sich von der Basalmembranen lösen

Bakterielle Zersetzung kann Autolyse imitieren

30
Q

Was gibt es für unterschiedliche Fixierungen (Methoden)?

Histologische Präparate

A

Physikalische Fixierung
* Erhitzen, einfrieren, trocknen

Chemische Fixierung
* Immersionsfixierung
* Perfusionsfixierung: Perfusion mit Fixierungsmittel während der Tötung in Tierversuchen&raquo_space; ergibt Proben von höherer Qualität im Vergleich zur Immersionsfixierung

31
Q

Wie funktioniert die chemische Fixierung mit Formaldehyd?

Histologische Präparate

A

Prinzip: Crosslinking von Proteinen (fixiert, Erhalt der Sekundärstruktur)

  • Crosslinking führt zu einer Koagulation von Proteinen&raquo_space; härtender Effekt auf weiches Gewebe
  • Fixiermedien fixieren auch eine Zahl von Kohlenhydrat- und Fett-enthaltende Makromoleküle, die ansonsten bei der weiteren Verarbeitung verloren gehen würden

Nicht so wichtig:
* Formalin: 35 - 37% Formaldehyd in wässrigen Lösung
* Meist genutzt: 10% neutral gepuffertes Formalin (4% ige wässrige Lösung von Formaldehyd; Ameisensäure durch Calciumcarbonat neutralisiert)
* Paraformaldehyd (für die Perfusion, muss frisch hergestellt werden)

Aktuelle Themen der ernährungswissenschaftlichen Forschung (10 decks)

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