Protein oprensning Flashcards
Hvilke egenskaber kan man lave karakterisering og oprensning på baggrund af?
pI, masse, størrelse/form, ladning, ladningsfordeling, ligand binding, opløselighed og hydrofobicitet
Opskriv masseladningsbrøken for massespektrometri
Masse-ladningsbrøken m/z er givet ud fra massen af analytten M, den påsatte ladning X (for protonet er den 1) og antallet af ladninger, n, ved
m/z=M+n·X / n
Hvad er fælles for søjlekromatografi og hvor mange typer findes der?
3 typer af søjlekromatografi:
Ionbytter, størrelseseksklusion og affinitets kromatografi.
Fælles:
Stationær fase = matrix med et søjlemateriale.
Mobil fase = man forbereder søjlen med en buffer.
Herefter tilsættes en buffer med protein.
Når proteinerne vandre gennem søjlen adskilles de, fordi nogle migrere hurtigere end andre.
Hvad afhænger proteinets affinitet til matrix af i ionbytterkromotografi?
Et proteins affinitet afhænger af pH, da det vil bestemme ioniseringsstadiet af proteinet, og koncentrationen af konkurrerende saltioner i bufferen.
Når et protein er bundet til matrix i ionbytterkromatografi, hvordan bryder det sin binding og eluderes?
Man vil efter proteinets binding introducere ioner i overskud, der vil udkonkurrer proteinets binding til matrix, og proteinet vil eluderes.
Hvilke proteiner vil eluderes først ved henholdsvis anion- og kationbytter
Anion (positiv matrix) vil tilbageholde proteiner med en negativ ladning, og derfor vil positivt ladet proteiner eluderes først.
Kation (negativ matrix) vil tilbageholde proteiner med en positiv ladning, og negativt ladet proteiner eluderes først.
Beskriv princippet bag størrelseseksklusion kromatografi
Søjlematrix (stationær fase) består af krydsforbundne polymerkugler.
Små proteiner bliver tilbageholdt af kuglernes porer, og derfor eluderes større proteiner hurtigst
Beskriv princippet bag affinitetskromatografi
Matrix i søjlen indeholder en kovalent bundet ligand, der specifikt binder sig til proteinet fx. ATP.
Når proteinet binder til liganden vil det blive tilbageholdt i søjlen, og vil eluderes sidst.
Der bliver tilsat ekstra ligand i overskud, så bindingen mellem ligand og matrix vil blive brudt, så proteinet nu med ligand vil udfældes.
Hvad kan fordelen være ved at gensplejse et protein med GST?
GST er affinitets tag, da det er i stand til at binde glutathion (ligand). Derfor vil man ved rebombinant ekspression af protein efter fusion med taget kunne oprense det ved affinitets kromatografi
Hvordan kan man “overvåge” sin oprensnings proces?
Ved at udfører en gelelektroforese undervejs. På denne måde kan man holde øje med renheden af opløsningen
Hvad består gelen af i elektroforese og hvordan virker den?
Gelen består af krydsbundet polyakrylamid. Gelen fungere som en molekyle “si”.
De korteste proteiner vil vandre længst
Hvad er SDS og hvilken betydning har det for ladning og eventuelle subunits?
SDS er et negativt ladet molekyle, der har en lang lipidkæde. Det skærmer selve proteinets ladning.
Der binder 1 SDS per 2 aminosyre.
Hvis der er flere subunits vil disse blive adskilt.
Hvad får proteinet til at vandre i en elektroforese og hvordan kan molekylevægten estimeres?
Proteinet bliver skærmet med en negativ ladning, og bliver placeret i et elektrisk felt, og vil vandre mod en positiv pol.
De korteste proteiner vil vandre længst, og man sammenholder den relative vandring med kendte molekylemasser.
Det ukendte proteins masse kan plottes som logaritmen til de kendte molekylemasser som funktion af den relative migration.
Hvordan afhænger et proteins ladning af pH ift. pI
Hvis pH er mindre end pI er der et overskud af positive ladninger.
Hvis pH = pI er ladningen 0
Hvis pH er større end pI er der et overskud af negative ladninger.
Beskriv princippet bag isoelektrisk fiksering
Isoelektrisk fokusering bruger pI til at adskille proteiner.
Proteinet nedsættes i en gel med en pH-gradient dannet af amfolytter.
Proteinet nedsænkes ved katoden (negativ) og vil vandre mod anoden (positv).
Vandringen stopper når proteinet har nået pI.
Hvilke teknikker er fin teknikker og hvilke er grov teknikker og hvad betyder det?
Grovteknik betyder stor kapacitet, men lille resolution. Det er fx. isoelektrisk fiksering.
Fintekning betyder lille kapacitet, men stor resolution. Det er søjlekromatografi og elektroforese.
Hvad er massespektrometri?
Det er en ikke kvantitativ måde at estimere et proteins vægt helt ned til Da.
Ved massespektrometri ioniseres proteinet i et vakuum.
Det ladet protein sendes gennem et elektrisk eller magnetisk felt.
Proteinets bevægelse i feltet er et udtryk for forholdet mellem masse og ladning m/z
Beskriv princippet bag elektrospray massespektroskopi
Proteinerne tvinges fra flydende form direkte til gasform.
Flydende protein sprayes gennem en elektrisk ladet nål ind i et rum med høj spænding. De multiladet proteiner kommer ud som små dråber og vil svæve.
Deres flyvning vil være afhængig af deres masse/ladnings forhold (m/z)
Beskriv det spektrum, der fås, ved elektrospray
Det spektrum, der opnås er meget kompliceret, og det kan være svært at tolke
Beskriv MALDI TOF massespektroskopi
En matrix dopes med proteiner, der får tilført energi ved UV-laser.
Matrixen absorbere energien, der bliver til varme. Det resultere i små lokale “eksplosioner”, så proteinerne bliver ioniseret med protoner.
Proteinerne vil herefter fordampes og være på gasform.
Beskriv Tandem MS/MS
MS/MS betyder at det er 2 massespektroskopi analyser efter hinanden.
MS1 = elektrospray analyse af en opløsning af polypeptider. Heraf udvælges 1 peptid til analyse.
MS2 = det ioniserede peptid sendes ind i et kollisionskammer, hvor det fragmenters en aminosyre af gangen.
Ionen/ladningen kan sidde på N-terminalen for Y.
Ion/ladningen kan også sidde på C-terminalen for B.
Hvad skal man være særligt opmærksom på når man tolker massen af peptidet, Y- og B-ioner fra et Tandem MS/MS?
Leucin og Isoleucin har samme masse, og man kan derfor ikke vide, hvilke aminosyre det er.
Man skal samtidig være opmærksom på den samlede masse af det oprindelige peptid.
