Hetreolog ekspression og posttranslationel modifikation Flashcards
Beskriv den komplementære interaktion mellem proteiner og ligander
Interaktioner mellem et protein og en ligand kræver typisk ikke en prostetisk gruppe, men aminosyreresterne er arrangeret således at de er specifikke til en eller flere ligander.
Det er en reversibel binding, der er mellem proteiner og deres ligander.
Beskriv en vektor
En vektor kan overfører rekombinant DNA til en værtscelle i en klonbar form
Beskriv en ekspressionvektor
En ekspressionsvektor indeholder en promoter, der fortæller RNA-polymerase, hvor den skal binde til genet.
Den indeholder også et ribosom-bindingssite, der tillader translation af mRNA til protein
Beskriv et plasmid, herunder regionerne Ori, resistens gener og sites for cleavage
Plasmider er cirkulært DNA på mellem 5.000-40.000 bp, der bliver replikeret uafhængigt af cellens øvrige DNA.
Det findes naturligt i bakterier.
Ori: igangsætter replikation af DNA, og styrer antallet af plasmider i en celle.
Resistens gener: er mod fx. ampicillin, der gør at man kan dræber de celler, der ikke har plasmidet.
Sites for cleavage: er steder hvor restriktionsenzymer kan klippe
Beskriv fordele og ulemper ved hetreolog ekspression i bakterier
Fordele:
Regulatoriske sekvenser, der regulere udtrykket af gener, er eksperimentelt godt forstået.
De er billige og lette at gro i laboratoriet.
Der findes effektive metoder for at få DNA ind og ud af bakterier
Ulemper:
Mange af de post translationelle modifikationer er ikke mulige i en bakterie.
IDP’er er svære at få udtrykt, da de primært findes i eukaryoter.
Beskriv fordele og ulemper ved hetreolog ekspression i gærceller
Fordele:
De regulatoriske mekanismer mener meget om dem i bakterier, og er veldefineret.
Gærceller er eukaryote celler og har et ER.
De er bedre til at udtrykke eukaryote gener og folder oftere proteinerne til deres aktive form.
Ulemper:
Kan have svært ved at udtrykke nogle gener.
Kan mangle enzymer til post translationelle modifikationer af proteinet til den aktive form.
Beskriv fordele og ulemper ved hetreolog ekspression i en mammal cellekultur
Fordele:
Benytter virus, der er specialiseret i at indsætte sit eget DNA eller RNA ind i en eksisterende celle.
Det benytter eksisterende virus promotorer, til at udtrykket genet.
Genet kan enten indsættes direkte i værtscellens genom eller virus DNA, og vil med tiden blive nedbrudt af værtscellen.
Ulemper:
Er meget dyrt
Metoden benyttes oftest til at teste et proteins funktion i en intakt celle, fremfor at producere et protein i stor skala.
Beskriv restriktionsenzymer, deres funktion og deres klipningsmetoder sticky ends og blunt ends
Restriktionsenzymer er enzymer, der genkender specifikke DNA-sekvenser og klipper efter det.
Restriktionsenzymer har naturligt til formål at klippe fremmed DNA, da værtscellens DNA vil være methyleret.
Klipningen kan være lige over - blunt ends
Klipningen kan være skæv - sticky ends
Forklar de 5 trin i forbindelse med kloning af DNA-fragmenter
- Genet separeres ved klipning med restriktionsenzymer.
- En kloningsvektor klippes med samme restriktionsenzym
- DNA-ligase forbinder vektor og DNA kovalent
- Det rekombinante DNA overføres til en værtscelle
- Alle celler, der ikke har fået vektoren dræbes.
Beskriv Tags og deres funktion
Tags er sekvenser, der bliver fusioneret med det ønskede protein, således at det er i stand til at binde ikke-kovalent til en stabil ligand.
Proteinet kan herefter oprenses ved affinitets kromatografi.
Beskriv Tags His-6, Green fluorescent protein og Glutathion S-transferase
His-6 tag er et Tag, der består af 6 His aminosyrerester.
GFP kan udseende fluorescerende lys
GST bruges særligt til affiniteskromatografi
Beskriv kort PCR
PCR er en metode, som bruges til at duplikere DNA. Først opvarmer man DNA, hvorefter man tilsætter en primer, som sætter sig på DNA´et. Så har vi en DNA-polymerase, som sætter sig på og tilfører nukleotider til den ødelagte streng. Herefter opvarmes DNA´et igen.
Beskriv hvordan et Western-blot fungere
Man bruger primære og sekundære antistoffer på et protein i gel, som svarer til SDS.
SDS-page bruges analytisk, for at finde ud af hvilke proteiner, man ønsker at oprense, da det separere proteiner efter størrelse.
Proteiner overføres til filterpapiret ved at danne et spændingsfelt, hvor papiret bliver positivt. Fordi proteinerne er negative vil de overføres dertil
Forklar en post translationel modifikation.
Forekommer de hyppigst i eukaryoter eller baktier?
En post translationel modifikation er alle kovalente ændringer, der sker efter translationen af et protein.
De forekommer hyppigst i eukaryote celler, da de har både Er og Golgi.
Jo mere kompleks en organisme er, jo flere PTM’er er der
Hvad karakterisere et signalpeptid?
Signalpeptidet består af 13-36 aminosyrerester, hvoraf 10-15 aminosyrerester er hydrofobe.
Der er ofte placeret en positivt ladet aminosyre tæt på amino-terminalen - denne ende translateres først.
Der er ofte korte sidekæder placeret tæt på carboxyl-terminalen (cleavage-site).
Signalpeptidet skæres af, af signal peptidase når proteinet kommer ind i ER
