Strukturbestemmelse

Question 1

Hvad er kemisk skift?

Answer 1

Et mål for hvor meget atomer skærmes af omgivelserne. Det bruges i NMR og måles i ppm

Question 2

Hvad er Nuclear Overhauser effect (NOE)?

Answer 2

Det anvendes efter man har lavet NMR og skal lave et NMR fingerprint. Det bruges til at finde ud af hvilke atomer, som er tæt på hinanden. Man måler intensiteten på hydrogen-atomer. Intensiteten er proportional med afstanden. Man kan max måle ting omkring 5 Å fra hinanden

Question 3

Hvad er Afstandsbegrænsninger (distance restriants)?

Answer 3

Afstandsbegrænsingerne er afledt af NOE. Dette bruges til at sige noget om den overordnede geometri (sekundær, tertiære og kvaternær struktur) De kan det ikke fortælle noget om vinklerne.
Man måler hvor tæt atomer er placeret på placeret på hinanden

Question 4

Hvad er forskellen på accuracy og precission?

Answer 4

Accurracy er hvor korrekt et resultat er, mens precission er hvorvidt forsøget kan gentages med samme resultater.

Question 5

Hvad er rmsd?

Answer 5

Hvis man laver den samme struktur mange gange i træk, hvor meget ligner de så hinanden. Den bruges ifm. NMR og den er bedst, hvis den er lille.
Den har noget med precision at gøre

Question 6

Hvad er ensembles?

Answer 6

Ifm. NMR spektroskopi er det de strukturer, som man har fået af forskellige NMR spektroskopi undersøgelser. Dvs. det er de forskellige proteinstrukturer, som man har identificeret med NMR

Question 7

Hvad er viltrifisering?

Answer 7

Det betyder hurtig nedfrysning og det anvendes til cryoEM. Man ønsker uordende vand krystaller, hvilket opnås ved en hurtig frysning.

Question 8

Hvad er diffraktion?

Answer 8

Ordet betyder afbøjning af elektromagentiske bølger, dvs. bøjning af bølger. Man sætter det ifm krystallografi, hvor man afbøjer røntgenbølger over en krystal (krystalliseret form af prøve stof)

Question 9

Hvad er elektrontæthedskort (Røntgenkrystallografi)?

Answer 9

Et elektrontæthedskort bruges til at se hvor tæt elektroner er placeret på hinanden. Jo bedre en undersøge er, jo mere ville man kunne se et molekyles form ud fra et elektrontæthedskort

Question 10

Hvad menes med faser og hvad er faseproblemet (røntgenkrystallografi)

Answer 10

Fase releterer sig til hvor på en bølge man befinder sig. Med et diffraktionsmønster, kan man ikke se, hvor på bølgen (fasen) man er, hvilket besværliggør beregningen af elektrontæthedskorte

Question 11

Hvad er forfining (refinement) for røntgenkrystallografi?

Answer 11

Det er de sidste matematiske beregninger af en struktur bestemt med krystallografi. Det er her man får strukturen til at passe ift steriske hindringer og tilladte vinkler.

Question 12

Hvad er R-faktor og B-faktor for x-ray diffraktion?

Answer 12

R-faktor er et mål for hvor godt modellen passer med elektrontætheden. Den må max være 0,2 for en god struktur.

B-faktoren siger noget om sandsynligheden for at et atom er placeret korrekt. Dette svarer til præcison. Her ønskes der en lav værdi

Question 13

Beskriv CD og tegn spektrum for alfa-helix, beta sheet og random coil

Answer 13

Enhver form for strukturel asymmetri (chiralitet) i et molekyle, giver ophav til forskellige i absorption af venstre vs. højrehåndet polariseret lys. Proteiner er chirale og kan derfor også undersøges med CD.
Man måler ellipcticiteten, som er givet ved forskellen mellem absorptionen for højre- og venstredrejet lys.

Question 14

Hvad er et elektrontæthedskort og hvilken metode bruges til at frembringe det?

Answer 14

Et elektrontæthedskort laves med røntgenspektroskopi. Man får et diffraktionsmønster, hvor hver prik repræsentere elektrontætheden et pågældende sted.

Question 15

Hvad siger NMR spektroskopi noget om?

Answer 15

Proteiners dynamik, konformationelle ændringer, foldning, ioniseringsstadiet og interaktion med andre molekyler

Question 16

Forklar metoden/princippet bag NMR

Answer 16

NMR måler det kemiske skift. Man bestråler proteinet med en højenergi radiobølger i et magnetisk felt.
Det får kernen til at skifte energitilstand, og man måler emissionen.
Man får nogle forskellige peaks ud, der er forskellige for alle kerne, og intensiteten af peaket vil stige, jo flere ens kerner der er.

Question 17

Beskriv hvad der menes med tilordningsprocessen i NMR spektroskopi

Answer 17

Tilordningsprocessen betyder at man finder ud af hvilke peaks, der passer til hvilke atomer.
Den strukturelle information kan bruges til at finde ud af hvilke atomkerner, der er placeret tæt på hinanden.

Question 18

Beskriv hvad der opnås ved en NOESY efter en NMR

Answer 18

Man laver et fingerprint på baggrund af dipol-dipol interaktioner mellem atomer, der er placeret tæt på hinanden.
Man undersøger typisk med forskellige afstandsbegrænsninger

Question 19

Hvilke oplysninger skal en computer bruge for at kunne generere en 3D-struktur af et protein?

Answer 19

Afstandsbegrænsninger, chiralitet, van der Waals-radier for atomerne, længder for bånd og deres vinkler.

Question 20

Forklar hvad der sker når noget absorbere lys

Answer 20

En elektron i det absorberende molekyle, dvs. kromoforen, bliver exciteret - løftet til et højere energi niveau.
Det er kun Phi-elektroner, der kan flyttes (dobbeltbindinger).

Question 21

Forklar hvad der sker når noget fluorescere

Answer 21

Når et molekyle er i exciteret tilstand vil det spontant afgive en foton, for at komme tilbage til sin grundtilstand.
Fotoner sendes ud i alle retninger, og dens energi er lavere end den, der blev absorberet

Question 22

Hvilken betydning har solventet for et fluorescens spektrum, og hvorfor?

Answer 22

Hydrofobt solvent = blåskifte til kortere bølgelænger (højere energi)
Hydrofilt solvent = rødskifte til længere bølgelængder (lavere energi)
Det skyldes at der vil ske dipol interaktioner med solventet, som vil bruge noget af energien.

Question 23

Forklar begrebet quenching i relation til fluorescens

Answer 23

At noget quencer betyder at der sker et fald i fluorescens intensiteten.
Det kan fx. være binding af en ligand, udfoldning af proteinet eller interaktioner med solventet

Question 24

Hvad er quantum yield?

Answer 24

Det er forholdet mellem antallet af fotoner, der bliver absorberet ift. antallet af fotoner, der udsendes ved fluorescens.
Det omhandler fluorescensintensiteten.

Question 25

Forklar FRET ift. fluorescens og hvilken afstand det kan ske over

Answer 25

Det skyldes dipol-dipol interaktioner mellem 2 floroforer, der har et overlap i emissions og absorptions spektrum.

Donoren (den første) kan lave en dipol-dipol interaktion til acceptoreren (den anden). Dermed sker der en “overførsel” af energi.
Dette skyldes IKKE en afgivelse eller modtagelse af fotoner.

Acceptoreren vil selv afgive lyset igen, men ved en længere bølgelængde end doneren.
FRET er begrænset til 20-100 Å

Question 26

Hvad kan CD bruges til?

Answer 26

At vurdere, hvor mange alfa-helixer og beta-sheets der er i at protein.
Det kan også bruges til at overvåge foldnings- eller udfoldningsprocesser, da der udsendes en kortere bølgelængde (høj energi), hvis proteinet er foldet ift. udfoldet.
Det skyldes at peptidbindingerne er fikseret i deres asymmetrisk stand.

Question 27

Hvad er ANS? Hvordan fungerer stoffet?

Answer 27

Et hydrofobisk molekyle, der kan binde til hydrofobe patches/lommer og skærme for det polære solvent, så der sker et blåskifte i fluorescensspektret. Quantum yield stiger også.

Question 28

Forklar resolution

Answer 28

Resolution bruges i NMR, Røntgen krystallografi og CryoEM.
Resolution er et mål for, hvor meget data, der er indsamlet og brugt.
Det måles i Å. Jo lavere et tal (Å), jo flere data, og i princippet jo bedre et resultat.
Det siger noget om hvor god opløsningen er.

Question 29

Beskriv kort CryEM

Answer 29

Oprenset protein kommes på en plade med en negativ farve.
Orienteringen af proteinet fryser når man sætter et på pladen.
Man kan derfor tage billeder af proteinet fra alle vinkler med et elektronmikroskop.

Question 30

Forklar metoden bag røntgen krystallografi

Answer 30

Proteinet skal pakkes som krystaller. Det er yderst svært at krystallisere proteiner.
Radiobølger sendes mod proteiner, der er placeret på en detektor.
Prikkerne, der formes er refleksioner.
Hvert atom i molekylerne blidrager til refleksionerne.

Et elektrondensitets kort kan beregnes ud fra prikkerne, og der kan dannes en model.

Question 31

Hvad er fordele og ulemper ved røntgenkrystallografi

Answer 31

Fordele: hurtig proces, når proteinet er på krystalform, meget præcist og ingen størrelses begrænsning.

Ulemper: det er svært at få et protein på krystalform. Det kan ændre på konformationen af proteinet. Faseproblemet og hydrogenatomer kan ikke ses.

Question 32

Hvad er fordele og ulemper ved CryoEM?

Answer 32

Fordele: god til store strukturer

Ulemper: har ikke en særligt god resolution (opløsning), kan ikke analysere IDP’er

Question 33

Hvad er fordele og ulemper ved NMR spektroskopi?

Answer 33

Fordele: det er relativt præcist. Det er muligt at se på IDP’er. Det kan laves in vivo og hydrogenatomer kan godt ses.

Ulemper: er begrænset til små strukturer, da ændringen i det kemiske spin bliver mindre jo større strukturen er. Det er en langsommelig proces. Det kræver en høj koncentration.

Question 34

Hvilke kriterier kan anvendes til vurdering af et proteins strukturkvalitet?

Answer 34

B-faktor, R-faktor, rsmd, resolution, akkurathed og præcision

Question 35

Hvorfor mangler hydrogenatomer oftest i en røntgen krystallografi?

Answer 35

Hydrogen har kun en elektron, hvilket gør at det kan være svært at måle elektrontætheden for den, da den også altid er i binding med et andet atom.

Question 36

Hvad er ekstinktion koefficienten?

Answer 36

Ekstinktion koefficienten er evnen til at absorbere lys som funktion af bølgelængde. Denne er forskellig for alle atomer.

Question 37

Hvordan kan man estimere den gennemsnitlige molekylevægt for et protein med n aminosyre?

Answer 37

110 g/mol * n + 18 g/mol (vand) = molekylevægt for protein

Question 38

Hvordan ville IDP’er se ud i et NMR spektrum?

Answer 38

Der vil være stor samling af prikkerne, der vil illustrere at der er en stor andel random coil.