Principe de la coloration, coloration nucléaire et éléments non-nucléaires

Question 1

But de la coloration

Answer 1

Teindre élément ou substance de manière durable
Colo influencée par prise sélective de réactifs par les tissus et par la perte sélective de produits et/ou réactifs par ces tissus (dépend de affinité et quantité du produit cool par rapport à l’élément tissulaire visé)

Question 2

Absorption

Answer 2

Propriété de la plupart des colo
Colo abs DANS le tissu et formation de liens chimiques ensuite
ex: colo des lipides

Question 3

Adsorption

Answer 3

Attraction des particules à la SURFACE
Point de rencontre colo-tissu (ensuite soit entre dans le tissu ou fait liens right la)
Si n’entre pas, fait liens fragiles qui résistent mal à la différenciation

Question 4

Porosité tissulaire

Answer 4

AKA perméabilité
Dépend du tissu
Colo entre dans tissu par pores
2 facteurs influencent:
1. taille molécule cool
2. densité de la structure (plus dense: GR, muscle, cytoplasme, collagène: moins dense)

Question 5

Mécanismes chimiques

Answer 5

1. liaisons chimiques (électrostatique, liens sels, ioniques): svt colo pas de charge, besoin de la développer, attirance de charges inverses
2. liaisons hydrogène: liaisons avec H2O, N, F, Cl, fragile
3. liaison covalence: entre les sites réactifs tissulaires et les auxochromes (partage d’é
4. Forces Van der Waals: seulement sur petites distances, attraction électrostatique entre é d’un atome et le noyau de l’atome voisin. très fragile (ex: colo d’élastine)

Question 6

PR-

Answer 6

Amphotères (amine: NH3+ et carbonyle: COO-)

Veut seulement une charge pour pas que tous les colo s’attachent

Question 7

Colorants

Answer 7

Plupart composés de sels complexes avec tendance acide ou basique
Similaire aux PR- (nature dépends de radicaux: NH3+, COO-, SO3-)
Groupe + et - = amphotère

Question 8

Si une structure tissulaire est +

Answer 8

Basique
Aime colo acide (-)
acidophile
ex:
cytoplasme
muscles
collagène
GR

Question 9

Si une structure tissulaire est -

Answer 9

Acide
Aime colo basique (+)
basophile
Ex: noyau (ADN/ARN)

Question 10

Colo directe

Answer 10

Usually ca qu’on use
Naturelle (pas besoin d’apport est)
ex: éosine

Question 11

Colo indirecte 1

Answer 11

Colo pas d'affinité pour structure
Besoin mordant (fait le lien entre 2 structures)
Complexe colo-mordant = laque
ex: hématoxyline + aluminium = laque d'hématéine
ex de mordant: Al, Fe, SO4, Cr
1. mordant dans fixateur (ex: Bouin)
2. mordant avant colo (pas souvent)
3. mordant mélangé avec colo

Question 12

Colo indirecte 2

Answer 12

Agent de rétention qui permet de retenir la colo (pas un trait d’union, retient colo déja en place)
Empêche décolo (principale utilité)
ex: Verheoff pour fibres élastiques
Colo un peu d’affinité pour le tissu

Question 13

Accentueur et accélérateur

Answer 13

Augmente le pouvoir de colo de certaines solutions

Augmente parfois la sélectivité de certains colo pour structures

Question 14

Coloration progressive

Answer 14

Arrête colo à temps voulu

Question 15

Colo régressive

Answer 15

Surcoloration et ensuite décoloration lente avec un solvant pour avoir les même résultats que progressive (quand seulement les éléments voulus on la teinte voulue)

Question 16

Différentiation par excès de mordant

Answer 16

Doit avoir eu utilisé mordant pendant colo
Par effet de compétition (retrait de colo)
Déttachement du colo et liaison avec mordant (excès) en solution
Pas la même chose que décolo qui enlève tout

Question 17

Différentiation par acide

Answer 17

Acide brise le lien mordant-tissu

Question 18

Mécanismes d’action de la colo nucléaire

Answer 18

Mal connu
2 mécanismes:
1. colo avec colo basique (+) sur ADN (-)
2. colo avec colo combin. ou suivit d’un mordant métallique (-) sur nucléohistones (+)

Question 19

Colorants nucléaires cationiques (+)

Answer 19

Ionisation des groupes amines (+) du colo en solution acide
3 types d’anions tissulaires (noyau):
1. groupe phosphate (ac. nucléique): PO4 -> PO3-
2. groupe esters (sulfatés): SO4 -> SO3-
3. groupes carboxyles (glucides): COOH -> COO-

Question 20

Comment pH influence propriétés des colo basiques

Answer 20

pH 1.0: seuls groupes sulfatés (structures riches en hydrates de carbone) seront colorés
pH 2.5-3.0: colo groupes sulfatés et phosphates
pH 4.0-5.0: colo tous les groupes
pH > 5.0: colo de tous les groupes anioniques, neutres et basiques des PR- et s’intensifie plus le pH augmente

Question 21

pH routine colo basiques

Answer 21

3.0-5.5

Ne colore donc pas les noyaux de façon très spécifique

Question 22

Bleu de toluidine O

Answer 22

Seul ou contrecolo
Acidifié par ac acétique glacial
Rinçage ou déshydratation peut causer perte de colo
- essuyer lame sur papier filtre et déshydrater avec n-butanol
Noyaux et hydrates de carbone acides: bleu
Certaines structures contanant des HC: rouge par métachromasie
ARN cytoplasme (coprs de Nissi): bleu

Question 23

Rouge neutre

Answer 23

Acidifié par ac acétique glacial
Rinçage ou déshydratation peut causer perte de colo
Peut utilisé comme fluorochrome
Noyaux et autres structures basophiles: rouge (Safranine O donne même résultats, mais plus long)
Noyaux et ARN cytoplasmique: jaune-orange en fluorescence

Question 24

Vert de méthyle

Answer 24

Rincer rapidement dans l’eau
Acétone ou n-butanol pour déshydratation
Noyaux et autres structures basophiles: vert-bleu

Question 25

Safranine O

Answer 25

# de groupements méthyle dans la molécule dertermine couleur du colorant: rouge ou orange --> métachromasie
Noyaux: rouge

Question 26

Mécanisme pour colo cytoplasmique (et autre éléments non-nucléaires)

Answer 26

Mieux connue
Due principalement aux PR- (leurs groupes chargés)
Peuvent être chargés + (NH3+) ou - (COO-) –> dépend du pH
Amphotères
pH < 6.0: +

Question 27

Colo non nucléaires

Answer 27

Majorité sont anionique (chargés -) et se combinent à des groupes tissulaires + (ex: a-a tels que arginine, histidine et lysine)

Question 28

Éosine

Answer 28

Colo ou contrecolo le plus utilisé
Entièrement chargé à 7.0, mais colo doit se faire < 6.0 puisque le point isoélectrique des PR- est 6.0 (veut que les PR- soient +)
Si pH  aspect muddy)
Meilleur résultat pH 4.6-5.0
Utilisé correctement = 3 tons de rose

Question 29

Chromogène

Answer 29

Partie coloré de la molécule
Chromophore = arrangement d’atomes dans chromogène qui est responsable de l’abs de lumière visible du spectre, déplace le système de résonance de la molécule
Plupart des colo ont radicaux additionnels qui modifient la couleur du composé

Question 30

Auxochrome

Answer 30

Partie qui s’attache au substrat
Chaine attachée au chromogène qui peut être:
1. groupe ionisant
2. groupe qui réagit pour former un lien covalent avec un substrat
3. arrangement d’Atomes qui forment des liens avec un ion métallique (mordant)
Plusieurs colo contiennent plus qu’un auxochrome
Nombre et type peut influencer la couleur d’un colo

Question 31

Résonance

Answer 31

Altération rapide et continue des liaisons doubles et simples dans la molécule
Système de résonance cause abs de certaines longueurs d’ondes (donne couleur)
Position de la résonance dans la molécule et la présence de groupes modificateurs détermine couleur vue
Résonance est caractéristique des composés aromatiques (benzène est la forme la plus simple)
Anneau stabilisé par résonance démontre un caractère aromatique
- Pour avoir couleur, besoin composé qui partage é
- é en mouvement abs bien
- couleur obtenue dépend de la position des é en mouvement
Pratiquement seulement les composés aromatiques ont un système de résonance (presque tous les colo ont configuration aromatique)

Question 32

Sortes de chromophores

Answer 32

C=C (éthylène)
C=O (carbonyle)
C=S (thiazole)
C=N (cyanique)
N=N (azo)
N= (indamine)
N=O (nitroso)
NO2 (nitré ou nitro)
Config quinonoid (pas aromatique, mais possède résonance) --> voir notes pour photo
Chromophores souvent présents sous forme combiné (ex: quinone-imine)

Question 33

Auxochromes basiques (+)

Answer 33

Sont des amines
Primaire -NH2 + H+  -NH3+
Secondaire NH + H+  NH2+
Tertiaire N + H+  NH+
Quaternaire N+ qui existe seulement sous forme ionique

Question 34

Auxochromes acides (-)

Answer 34

Dérivés des ac. sulphoniques ou carboxylique ou des groupements hydroxyles phénolés:
Sulphonic -SO3- + H+ ac. fort tjrs ionisé même quand pH bas
Carboxylique -COOH -COO- + H+ ac. faibles et sont seulement partiellement ionisés en solution aqueuse
Phénolique -Ar-OH -Ar-O- + H+ encore plus faibles

Les deux derniers ne peuvent donc pas exister sous la forme anionique en présence d’une concentration élevée H+ (pH bas)

Question 35

Classification des colo

Answer 35

1. Origine (naturelle ou synthétique)
2. méthode d’application
3. type de chromophore
4. color index

Question 36

1. Origine

Answer 36

Plus tellement utilisé ajd
Hématoxyline: bois d’un arbre (campêche)
Carmin: insecte (cochenille femele), rouge, pour glycogène et mucines, amphotère
Orcéine: lichens (colo végétal), bleu-violet quand oxydé, pour fibres élastiques et chromosomes
Safran: plante (crocus sativus), jaune, acide, pour collagène

Question 37

2. Méthodes d’application

Answer 37

Colo basique: colo cationique, charge +, auxochrome amine ex: fuschine basique
- habituellement utilisés à un pH bas pour supprimer l’ionisation des groupes hydroxyles et carbonyles, mais assez élevé pour permettre aux esters des ac. phosphoriques et sulfuriques (Ac. nucléiques et protéoglycanes) d’Exister sous forme d’anions et d’être colorés
Colo acide: anionique, chargé -, auxochrome acide (sulfonique ou carboxyles), plusieurs sont amphotères ex: éosine

Question 38

Colorants amphotères

Answer 38

Auxochrome acide et basique
Comportement dépend du pH
pH = pI aucune charge
pH < pI ionisation des groupes amines, comporte comme base
pH > pI ionisation des groupes carboxyles, comporte comme acide

Question 39

Colorant neutre

Answer 39

Mélange de 2 colo (anionique et cationique)

Question 40

Colo leuco

Answer 40

Détruit chromophore par réduction (remplacement du chromophore par atome hydrogène) –> système de résonance change et le composé devient incolore
Oxydation reforme le chromophore

Question 41

Colo fluo

Answer 41

Possèdent fluorochromes
Abs rayons UV alors sont incolores
Quand unis à une structure tissulaire émettent une lumière visible (longueur d’onde plus grande que la lumière abs)
Utilisés en microscopie à fluorescence

Question 42

3. Selon chromophores

Answer 42

Système chromophoriques majeurs

1. Groupe quinoide: chromophore = quinone, variations de couleur causées par d’autres groupes (chromophores) qui ont attachés à l’anneau quinone
   ex: fuschine basique, fuschine acide, violet de cristal, bleu aniline, éosine, hématéine
2. Groupe azo: -N=N- qui peut se retrouver plus d’une fois dans la molécule (1 groupe = azoique, 2 groupes = diazoique, 3 groupes triazoique)
   ex: Orange G, ponceau 3R, tartrazine, jaune de métanil, soudan IV, rouge méthyle, huile rouge, Biebrich écarlate, rouge Congo
3. Groupe nitré: -NO2, colo caractère acide, peut se retrouver plus d’une fois dans la molécule
   ex: acide picrique

Question 43

4. Color index

Answer 43

Système de numérotation pour chaque colo sur le marché
5 chiffres (2 premiers: chromophore, autres: caractère ionique)
Svt des lettres qui suivent le nom du colo
ex: R –> teinte rougeatre

Question 44

Hématoxyline

Answer 44

Origine naturelle
Doit oxyder pour donner colo actif
Colo sélective de la chromatine
Hématoxyline oxydation –> hématéine suroxydation –> oxyhématéine (not good)
Oxydation peut être naturelle ou chimique

Question 45

Oxydation chimique

Answer 45

24h max
agents oxydants: permenganate de K, bichromate de K, oxyde mercurique, iodate de Na, iodate de K, chlorure ferrique, chlorure mercurique
Certains produits de suroxydation sont insolubles et doivent être enlevés par filtration
HCl ralentit suroxydation

Question 46

Laques d’hématéine

Answer 46

Complexe hématéine - mordant
Colo indirecte
Tous métaux mordants sont cationiques et trivalents (Al3+, Fe3+)

Question 47

Hématoxyline aluminique notes

Answer 47

Laque rouge en acide et bleu en alcalin (bleuissement)
Alum de K ou Alum d’ammonium
2 étapes:
1. liaison mordant-colo
2. liaison mordant-tissu
Distribution dans tissu en fonction de l’affinité du mordant pour divers constituants
Aluminium tendance lier fonctions phosphates des ac. nucléiques et les groupes acides (sulfates de mucopolysaccharides acides)

Question 48

Hématoxyline tungstique, chromique ou molybdique

Answer 48

Ac. phosphotungstique
Alum de chrome
Ac. phosphomolybdique

Question 49

Hématoxyline aluminique tableau AKA hémalum

Answer 49

Noms: Harris (solution alcoolique) ou Mayer (solution aqueuse)
Couleur noyaux: bleu
Couleur laque: rouge (milieu acide) bleu (milieu alcalin)
Mordant: tjrs incorporé dans colo, aluminium
Oxydant: iodate de Na pour Harris et Mayer
Mode d’utilisation: régressif (routine), progressif
Différenciateur: alcool-acide (rompt liaison laque-tissu)
Avantage: temps colo plus court
Inconvénient: résiste mal à certains colo acide (ex: ac. picrique) ou à des colo trop longues, couleur pâlit avec le temps

Question 50

Hématoxyline ferrique tableau

Answer 50

Noms: Weigert (solution alcoolique) ou Verhoeff (solution alcoolique)
Couleur noyaux: noir
Couleur laque: noir indépendant du pH
Mordant: incorporé dans la solution avant l’emploi ou faire un bain de mordant et un bain d’hématoxyline (Heidenhain), chlorure ferrique
Oxydant: chlorure ferrique
Mode d’utilisation: régressif (Verhoeff souvent), progressif (Weigert si précède solutions acides)
Différenciateur: Weigert –> alcool-acide, Verhoeff et Heidenhain —> chlorure ferrique par excès
Avantages: Résiste bien à l’action des colo acides (liaison mordant-tissu moins sensible au pH), couleur se conserve bien et peuvent servir à la colo de d’autres structures (fibres élastiques avec Verhoeff)
Inconvénients: Plusieurs solutions à préparer, temps plus long

Question 51

Problème HE: déparaffinage non complété

Answer 51

Apparence: taches ou zones blanches dans sections après déparaffinage
Cause: eau demeuré dans le tissu, séchage incomplet ou séjour trop court dans xylène pendant déparaffinage
Prévention: bien sécher coupes, laisser dans xylène assez longtemps, use pas xylène contaminé
Retrait/correction:
Mauvais séchage –> traite avec alcool absolu et remet dans xylène (si sévere tissu peut décoller de la lame pendant manipulation)
Si les coupes furent colorées –> décolore, traite et recolore

Question 52

Problème HE: manque de détails nucléaires

Answer 52

Apparence: ne peut pas voir motifs dans chromatine, colo nucléaire boueuse
Cause: fixation incomplète ou chaleur excessive lors de circulation ou séchage
Prévention: fixer complètement, déshydratation et éclaircissement complète avant imprégnation, limite chaleur à paraffine, ne laisse pas dans paraffine trop longtemps, sèche à température convenable et pendant moins longtemps possible (56 oC dans étuve habituellement)
Retrait/correction: pas de correction

Question 53

Problème HE: noyaux trop pâles

Answer 53

Apparence: noyaux pales, manque de contraste
Cause: pas assez longtemps dans hématoxyline, hématoxyline suroxydée, trop de différenciation ou décal excessive (si section d’os car acides diminuent basophilie du tissu)
Prévention: laisser assez longtemps dans hématoxyline, attn suroxydation, respecter temps de différenciation
Retrait/correction: augmenter temps dans hématoxyline ou augmenter basophilie du tissu, recolo après ID problème

Question 54

Problème HE: noyaux trop foncés

Answer 54

Apparence: noyaux trop foncés
Cause: trop longtemps dans hématoxyline, section trop épaisse, différenciation insuffisante
Prévention: bonne épaisseur, bon temps colo, bon temps différenciation
Retrait/correction: si section trop épaisse, décolo, ajuster temps, recolo

Question 55

Problème HE: noyaux rouge ou rouge-brun

Answer 55

Apparence: rouge ou rouge-brun
Cause: solution hématoxyline sur le point de ne plus être bonne ou bleuissement pas bien fait
Prévention: assurer bon bleuissement et vérifier état d’oxydation
Retrait/correction: aucun

Question 56

Problème HE: cytoplasme trop pâle

Answer 56

Apparence: cytoplasme trop pâle, pas tjrs 3 teintes
Cause: augmentation du pH éosine >5.0 (contamination par agent de bleuissement ou éosine non-acidifiée), section trop mince, séjour trop long dans alcool dilué après éosine (eau = decolo)
Prévention: rincer coupes après bleuissement (plus important que acidification), acidifier éosine, assurer bonne épaisseur, séjour dans alcool 95 pas trop long
Retrait/correction: décolo et recolo avec modifications

Question 57

Problème HE: éosine incorrectement différencié

Answer 57

Apparence: pas 3 teintes de rose
Cause: mauvaise fixation, déshyd et éclair. inadéquat, différenciation inadéquat, pH pas bon
Prévention: fixation complète, déshyd. et éclair. complètes, séjour dans alcool 95 adéquat
Retrait/correction: décolo et recolo si possible

Question 58

Problème HE: précipités bleu-noir sur sections

Answer 58

Apparence: précipités
Cause: mince couche métallique (laque) qui se développe sur hématoxyline ramassée par lame
Prévention: filtrer
Retrait/correction: aucun

Question 59

Problème HE: eau et coupes d’aspect brumeux ou laiteux

Answer 59

Apparence: coupes et bain d’Eau aspect laiteux après bains d’alcool pendant déparaffinage
Cause: xylène encore sur les coupes et dans bain d’eau
Prévention: bonne rotation des bains d’alcool
Retrait/correction: remonter étapes en changeant les bain d’alcool (reprendre étapes alcool et eau) et xylène

Question 60

Problème HE: eau et coupes d’aspect brumeux ou laiteux dans le dernier bain de xylène avant de monter la lame

Answer 60

Apparence: coupes laiteuses pendant dernier éclair.
Cause: eau sur coupes (déshydratation pas complète)
Prévention: alcool avant xylène
Retrait/correction: remonter étapes en changeant bains alcool et xylène

Question 61

Problème HE: colo irrégulière

Answer 61

Voir notes