Principe de la coloration, coloration nucléaire et éléments non-nucléaires Flashcards
But de la coloration
Teindre élément ou substance de manière durable
Colo influencée par prise sélective de réactifs par les tissus et par la perte sélective de produits et/ou réactifs par ces tissus (dépend de affinité et quantité du produit cool par rapport à l’élément tissulaire visé)
Absorption
Propriété de la plupart des colo
Colo abs DANS le tissu et formation de liens chimiques ensuite
ex: colo des lipides
Adsorption
Attraction des particules à la SURFACE
Point de rencontre colo-tissu (ensuite soit entre dans le tissu ou fait liens right la)
Si n’entre pas, fait liens fragiles qui résistent mal à la différenciation
Porosité tissulaire
AKA perméabilité Dépend du tissu Colo entre dans tissu par pores 2 facteurs influencent: 1. taille molécule cool 2. densité de la structure (plus dense: GR, muscle, cytoplasme, collagène: moins dense)
Mécanismes chimiques
- liaisons chimiques (électrostatique, liens sels, ioniques): svt colo pas de charge, besoin de la développer, attirance de charges inverses
- liaisons hydrogène: liaisons avec H2O, N, F, Cl, fragile
- liaison covalence: entre les sites réactifs tissulaires et les auxochromes (partage d’é
- Forces Van der Waals: seulement sur petites distances, attraction électrostatique entre é d’un atome et le noyau de l’atome voisin. très fragile (ex: colo d’élastine)
PR-
Amphotères (amine: NH3+ et carbonyle: COO-)
Veut seulement une charge pour pas que tous les colo s’attachent
Colorants
Plupart composés de sels complexes avec tendance acide ou basique
Similaire aux PR- (nature dépends de radicaux: NH3+, COO-, SO3-)
Groupe + et - = amphotère
Si une structure tissulaire est +
Basique Aime colo acide (-) acidophile ex: cytoplasme muscles collagène GR
Si une structure tissulaire est -
Acide
Aime colo basique (+)
basophile
Ex: noyau (ADN/ARN)
Colo directe
Usually ca qu’on use
Naturelle (pas besoin d’apport est)
ex: éosine
Colo indirecte 1
Colo pas d'affinité pour structure Besoin mordant (fait le lien entre 2 structures) Complexe colo-mordant = laque ex: hématoxyline + aluminium = laque d'hématéine ex de mordant: Al, Fe, SO4, Cr 1. mordant dans fixateur (ex: Bouin) 2. mordant avant colo (pas souvent) 3. mordant mélangé avec colo
Colo indirecte 2
Agent de rétention qui permet de retenir la colo (pas un trait d’union, retient colo déja en place)
Empêche décolo (principale utilité)
ex: Verheoff pour fibres élastiques
Colo un peu d’affinité pour le tissu
Accentueur et accélérateur
Augmente le pouvoir de colo de certaines solutions
Augmente parfois la sélectivité de certains colo pour structures
Coloration progressive
Arrête colo à temps voulu
Colo régressive
Surcoloration et ensuite décoloration lente avec un solvant pour avoir les même résultats que progressive (quand seulement les éléments voulus on la teinte voulue)
Différentiation par excès de mordant
Doit avoir eu utilisé mordant pendant colo
Par effet de compétition (retrait de colo)
Déttachement du colo et liaison avec mordant (excès) en solution
Pas la même chose que décolo qui enlève tout
Différentiation par acide
Acide brise le lien mordant-tissu
Mécanismes d’action de la colo nucléaire
Mal connu
2 mécanismes:
1. colo avec colo basique (+) sur ADN (-)
2. colo avec colo combin. ou suivit d’un mordant métallique (-) sur nucléohistones (+)
Colorants nucléaires cationiques (+)
Ionisation des groupes amines (+) du colo en solution acide
3 types d’anions tissulaires (noyau):
1. groupe phosphate (ac. nucléique): PO4 -> PO3-
2. groupe esters (sulfatés): SO4 -> SO3-
3. groupes carboxyles (glucides): COOH -> COO-
Comment pH influence propriétés des colo basiques
pH 1.0: seuls groupes sulfatés (structures riches en hydrates de carbone) seront colorés
pH 2.5-3.0: colo groupes sulfatés et phosphates
pH 4.0-5.0: colo tous les groupes
pH > 5.0: colo de tous les groupes anioniques, neutres et basiques des PR- et s’intensifie plus le pH augmente
pH routine colo basiques
3.0-5.5
Ne colore donc pas les noyaux de façon très spécifique
Bleu de toluidine O
Seul ou contrecolo
Acidifié par ac acétique glacial
Rinçage ou déshydratation peut causer perte de colo
- essuyer lame sur papier filtre et déshydrater avec n-butanol
Noyaux et hydrates de carbone acides: bleu
Certaines structures contanant des HC: rouge par métachromasie
ARN cytoplasme (coprs de Nissi): bleu
Rouge neutre
Acidifié par ac acétique glacial
Rinçage ou déshydratation peut causer perte de colo
Peut utilisé comme fluorochrome
Noyaux et autres structures basophiles: rouge (Safranine O donne même résultats, mais plus long)
Noyaux et ARN cytoplasmique: jaune-orange en fluorescence
Vert de méthyle
Rincer rapidement dans l’eau
Acétone ou n-butanol pour déshydratation
Noyaux et autres structures basophiles: vert-bleu
Safranine O
# de groupements méthyle dans la molécule dertermine couleur du colorant: rouge ou orange --> métachromasie Noyaux: rouge
Mécanisme pour colo cytoplasmique (et autre éléments non-nucléaires)
Mieux connue
Due principalement aux PR- (leurs groupes chargés)
Peuvent être chargés + (NH3+) ou - (COO-) –> dépend du pH
Amphotères
pH < 6.0: +
Colo non nucléaires
Majorité sont anionique (chargés -) et se combinent à des groupes tissulaires + (ex: a-a tels que arginine, histidine et lysine)
Éosine
Colo ou contrecolo le plus utilisé Entièrement chargé à 7.0, mais colo doit se faire < 6.0 puisque le point isoélectrique des PR- est 6.0 (veut que les PR- soient +) Si pH aspect muddy) Meilleur résultat pH 4.6-5.0 Utilisé correctement = 3 tons de rose
Chromogène
Partie coloré de la molécule
Chromophore = arrangement d’atomes dans chromogène qui est responsable de l’abs de lumière visible du spectre, déplace le système de résonance de la molécule
Plupart des colo ont radicaux additionnels qui modifient la couleur du composé
Auxochrome
Partie qui s’attache au substrat
Chaine attachée au chromogène qui peut être:
1. groupe ionisant
2. groupe qui réagit pour former un lien covalent avec un substrat
3. arrangement d’Atomes qui forment des liens avec un ion métallique (mordant)
Plusieurs colo contiennent plus qu’un auxochrome
Nombre et type peut influencer la couleur d’un colo
Résonance
Altération rapide et continue des liaisons doubles et simples dans la molécule
Système de résonance cause abs de certaines longueurs d’ondes (donne couleur)
Position de la résonance dans la molécule et la présence de groupes modificateurs détermine couleur vue
Résonance est caractéristique des composés aromatiques (benzène est la forme la plus simple)
Anneau stabilisé par résonance démontre un caractère aromatique
- Pour avoir couleur, besoin composé qui partage é
- é en mouvement abs bien
- couleur obtenue dépend de la position des é en mouvement
Pratiquement seulement les composés aromatiques ont un système de résonance (presque tous les colo ont configuration aromatique)
Sortes de chromophores
C=C (éthylène) C=O (carbonyle) C=S (thiazole) C=N (cyanique) N=N (azo) N= (indamine) N=O (nitroso) NO2 (nitré ou nitro) Config quinonoid (pas aromatique, mais possède résonance) --> voir notes pour photo Chromophores souvent présents sous forme combiné (ex: quinone-imine)
Auxochromes basiques (+)
Sont des amines Primaire -NH2 + H+ -NH3+ Secondaire NH + H+ NH2+ Tertiaire N + H+ NH+ Quaternaire N+ qui existe seulement sous forme ionique
Auxochromes acides (-)
Dérivés des ac. sulphoniques ou carboxylique ou des groupements hydroxyles phénolés:
Sulphonic -SO3- + H+ ac. fort tjrs ionisé même quand pH bas
Carboxylique -COOH -COO- + H+ ac. faibles et sont seulement partiellement ionisés en solution aqueuse
Phénolique -Ar-OH -Ar-O- + H+ encore plus faibles
Les deux derniers ne peuvent donc pas exister sous la forme anionique en présence d’une concentration élevée H+ (pH bas)
Classification des colo
- Origine (naturelle ou synthétique)
- méthode d’application
- type de chromophore
- color index
- Origine
Plus tellement utilisé ajd
Hématoxyline: bois d’un arbre (campêche)
Carmin: insecte (cochenille femele), rouge, pour glycogène et mucines, amphotère
Orcéine: lichens (colo végétal), bleu-violet quand oxydé, pour fibres élastiques et chromosomes
Safran: plante (crocus sativus), jaune, acide, pour collagène
- Méthodes d’application
Colo basique: colo cationique, charge +, auxochrome amine ex: fuschine basique
- habituellement utilisés à un pH bas pour supprimer l’ionisation des groupes hydroxyles et carbonyles, mais assez élevé pour permettre aux esters des ac. phosphoriques et sulfuriques (Ac. nucléiques et protéoglycanes) d’Exister sous forme d’anions et d’être colorés
Colo acide: anionique, chargé -, auxochrome acide (sulfonique ou carboxyles), plusieurs sont amphotères ex: éosine
Colorants amphotères
Auxochrome acide et basique
Comportement dépend du pH
pH = pI aucune charge
pH < pI ionisation des groupes amines, comporte comme base
pH > pI ionisation des groupes carboxyles, comporte comme acide
Colorant neutre
Mélange de 2 colo (anionique et cationique)
Colo leuco
Détruit chromophore par réduction (remplacement du chromophore par atome hydrogène) –> système de résonance change et le composé devient incolore
Oxydation reforme le chromophore
Colo fluo
Possèdent fluorochromes
Abs rayons UV alors sont incolores
Quand unis à une structure tissulaire émettent une lumière visible (longueur d’onde plus grande que la lumière abs)
Utilisés en microscopie à fluorescence
- Selon chromophores
Système chromophoriques majeurs
- Groupe quinoide: chromophore = quinone, variations de couleur causées par d’autres groupes (chromophores) qui ont attachés à l’anneau quinone
ex: fuschine basique, fuschine acide, violet de cristal, bleu aniline, éosine, hématéine - Groupe azo: -N=N- qui peut se retrouver plus d’une fois dans la molécule (1 groupe = azoique, 2 groupes = diazoique, 3 groupes triazoique)
ex: Orange G, ponceau 3R, tartrazine, jaune de métanil, soudan IV, rouge méthyle, huile rouge, Biebrich écarlate, rouge Congo - Groupe nitré: -NO2, colo caractère acide, peut se retrouver plus d’une fois dans la molécule
ex: acide picrique
- Color index
Système de numérotation pour chaque colo sur le marché
5 chiffres (2 premiers: chromophore, autres: caractère ionique)
Svt des lettres qui suivent le nom du colo
ex: R –> teinte rougeatre
Hématoxyline
Origine naturelle
Doit oxyder pour donner colo actif
Colo sélective de la chromatine
Hématoxyline oxydation –> hématéine suroxydation –> oxyhématéine (not good)
Oxydation peut être naturelle ou chimique
Oxydation chimique
24h max
agents oxydants: permenganate de K, bichromate de K, oxyde mercurique, iodate de Na, iodate de K, chlorure ferrique, chlorure mercurique
Certains produits de suroxydation sont insolubles et doivent être enlevés par filtration
HCl ralentit suroxydation
Laques d’hématéine
Complexe hématéine - mordant
Colo indirecte
Tous métaux mordants sont cationiques et trivalents (Al3+, Fe3+)
Hématoxyline aluminique notes
Laque rouge en acide et bleu en alcalin (bleuissement)
Alum de K ou Alum d’ammonium
2 étapes:
1. liaison mordant-colo
2. liaison mordant-tissu
Distribution dans tissu en fonction de l’affinité du mordant pour divers constituants
Aluminium tendance lier fonctions phosphates des ac. nucléiques et les groupes acides (sulfates de mucopolysaccharides acides)
Hématoxyline tungstique, chromique ou molybdique
Ac. phosphotungstique
Alum de chrome
Ac. phosphomolybdique
Hématoxyline aluminique tableau AKA hémalum
Noms: Harris (solution alcoolique) ou Mayer (solution aqueuse)
Couleur noyaux: bleu
Couleur laque: rouge (milieu acide) bleu (milieu alcalin)
Mordant: tjrs incorporé dans colo, aluminium
Oxydant: iodate de Na pour Harris et Mayer
Mode d’utilisation: régressif (routine), progressif
Différenciateur: alcool-acide (rompt liaison laque-tissu)
Avantage: temps colo plus court
Inconvénient: résiste mal à certains colo acide (ex: ac. picrique) ou à des colo trop longues, couleur pâlit avec le temps
Hématoxyline ferrique tableau
Noms: Weigert (solution alcoolique) ou Verhoeff (solution alcoolique)
Couleur noyaux: noir
Couleur laque: noir indépendant du pH
Mordant: incorporé dans la solution avant l’emploi ou faire un bain de mordant et un bain d’hématoxyline (Heidenhain), chlorure ferrique
Oxydant: chlorure ferrique
Mode d’utilisation: régressif (Verhoeff souvent), progressif (Weigert si précède solutions acides)
Différenciateur: Weigert –> alcool-acide, Verhoeff et Heidenhain —> chlorure ferrique par excès
Avantages: Résiste bien à l’action des colo acides (liaison mordant-tissu moins sensible au pH), couleur se conserve bien et peuvent servir à la colo de d’autres structures (fibres élastiques avec Verhoeff)
Inconvénients: Plusieurs solutions à préparer, temps plus long
Problème HE: déparaffinage non complété
Apparence: taches ou zones blanches dans sections après déparaffinage
Cause: eau demeuré dans le tissu, séchage incomplet ou séjour trop court dans xylène pendant déparaffinage
Prévention: bien sécher coupes, laisser dans xylène assez longtemps, use pas xylène contaminé
Retrait/correction:
Mauvais séchage –> traite avec alcool absolu et remet dans xylène (si sévere tissu peut décoller de la lame pendant manipulation)
Si les coupes furent colorées –> décolore, traite et recolore
Problème HE: manque de détails nucléaires
Apparence: ne peut pas voir motifs dans chromatine, colo nucléaire boueuse
Cause: fixation incomplète ou chaleur excessive lors de circulation ou séchage
Prévention: fixer complètement, déshydratation et éclaircissement complète avant imprégnation, limite chaleur à paraffine, ne laisse pas dans paraffine trop longtemps, sèche à température convenable et pendant moins longtemps possible (56 oC dans étuve habituellement)
Retrait/correction: pas de correction
Problème HE: noyaux trop pâles
Apparence: noyaux pales, manque de contraste
Cause: pas assez longtemps dans hématoxyline, hématoxyline suroxydée, trop de différenciation ou décal excessive (si section d’os car acides diminuent basophilie du tissu)
Prévention: laisser assez longtemps dans hématoxyline, attn suroxydation, respecter temps de différenciation
Retrait/correction: augmenter temps dans hématoxyline ou augmenter basophilie du tissu, recolo après ID problème
Problème HE: noyaux trop foncés
Apparence: noyaux trop foncés
Cause: trop longtemps dans hématoxyline, section trop épaisse, différenciation insuffisante
Prévention: bonne épaisseur, bon temps colo, bon temps différenciation
Retrait/correction: si section trop épaisse, décolo, ajuster temps, recolo
Problème HE: noyaux rouge ou rouge-brun
Apparence: rouge ou rouge-brun
Cause: solution hématoxyline sur le point de ne plus être bonne ou bleuissement pas bien fait
Prévention: assurer bon bleuissement et vérifier état d’oxydation
Retrait/correction: aucun
Problème HE: cytoplasme trop pâle
Apparence: cytoplasme trop pâle, pas tjrs 3 teintes
Cause: augmentation du pH éosine >5.0 (contamination par agent de bleuissement ou éosine non-acidifiée), section trop mince, séjour trop long dans alcool dilué après éosine (eau = decolo)
Prévention: rincer coupes après bleuissement (plus important que acidification), acidifier éosine, assurer bonne épaisseur, séjour dans alcool 95 pas trop long
Retrait/correction: décolo et recolo avec modifications
Problème HE: éosine incorrectement différencié
Apparence: pas 3 teintes de rose
Cause: mauvaise fixation, déshyd et éclair. inadéquat, différenciation inadéquat, pH pas bon
Prévention: fixation complète, déshyd. et éclair. complètes, séjour dans alcool 95 adéquat
Retrait/correction: décolo et recolo si possible
Problème HE: précipités bleu-noir sur sections
Apparence: précipités
Cause: mince couche métallique (laque) qui se développe sur hématoxyline ramassée par lame
Prévention: filtrer
Retrait/correction: aucun
Problème HE: eau et coupes d’aspect brumeux ou laiteux
Apparence: coupes et bain d’Eau aspect laiteux après bains d’alcool pendant déparaffinage
Cause: xylène encore sur les coupes et dans bain d’eau
Prévention: bonne rotation des bains d’alcool
Retrait/correction: remonter étapes en changeant les bain d’alcool (reprendre étapes alcool et eau) et xylène
Problème HE: eau et coupes d’aspect brumeux ou laiteux dans le dernier bain de xylène avant de monter la lame
Apparence: coupes laiteuses pendant dernier éclair.
Cause: eau sur coupes (déshydratation pas complète)
Prévention: alcool avant xylène
Retrait/correction: remonter étapes en changeant bains alcool et xylène
Problème HE: colo irrégulière
Voir notes
