Cryotomie et immunohistochimie Flashcards
Pourquoi congeler?
Plus rapide
Bx urgentes
Mide en évidence des lipides (best méthode)
Techniques en fluorescence (démonstration Ac): dermatologie (gèle, met sur lame, freezer, attend pour batch)
C’est quoi un cryotome?
Cryostat
Chambre réfrigérée contenant un microtome habituellement de type rotatif
Méthodes courantes
- azote liquide
2. OCT (optimum cutting temperature)
Azote liquide
4 secondes
Tissus mous craquent (expansion trop rapide)
Doit laisser tissu équilibrer à la temp. du cryostat sinon dommages bloc et couteau
Difficile a congeler tissu également (vapeur autour tissu isole)
Rarement utilisé seul –> souvent utilise isopentane en premier
OCT
Un produit chimique
Souvent utilisé dans labs d’histo
Pas tjrs besoin d’utiliser azote
Peut être utilisé seul
Effets de la congélation
- congélation lente: cristaux de glace de grosseur prop. à vitesse de congélation –> font des trous dans le tissu
- congélation rapide: craquage des tissus
- tissu trop froid: tissu tendance à pulvériser ou désagréger lors de la coupe
La coupe
Sections ramassées directement sur lame
Lame gardée TP alors va coller coupe
RT*** plaque anti-roulement permet d’empêcher la coupe de rouler sur elle-même –> doit être bien ajustée par rapport au couteau
Temp. interne du cryostat maintenue -20 oC
Coupes plus chaudes
Cerveau Foie Rate Nodules lymphoides Matériel endométrial
Couples plus froides
Tissu avec gras
Coloration
Ish la même que pour tissus fixés dans formol
H&E rapide avec étape rapide de fixation au tout début
Ne fait jamais de colo spéciales
Comment désinfecter
Vapeurs de formaldéhydes Glutaraldéhydes 2% Solution phénol 5% Alcool absolu Solutions commerciales de plus en plus utilisées (virox)
Maintenance du cryostat
Usually les vendredis fin de day –> comment souvent dépend du lab
1. décongèle
2. nettoyer
3. lubrifier (huile spéciale pour basses Temp.)
Cryostat doit être complètement asseché avant lubrification et avant de recongeler
Entre chaque Pt doit seulement enleber débrit de tissu avec gaz temp. piece (va coller dessus)
Troubleshooting: mécanisme devient raide
Souvent cuz eau/humidité
Traite avec alcool 100%, sèche, lubrifie de nouveau
Troubleshooting: tissu se fragmente
Temp. trop basse usually
Troubleshooting: tissu s’accumule sur bord de lame
Souvent cuz temp. trop huate (colle sur lame)
Angle du couteau
30 oC
Entreposage des tissus congelés
Enveloppe pour empêcher le contact avec l’air et sont mis à -70 oC sinon deshydratation
Fixer et traiter pour faire d’autres coupes avec colo spéciales ou tests d’immunohistochimie
Immunohistochimie: info générale
Remplace de plus en plus les colo spéciales –> Ac plus spécifiques –> colo spéciales peuvent s’attacher à d’autre endroits (moins spécifique)
Ag: structure recherchée
Ac: réactif
Complexe Ac-Ag invisible de nature so use Ac couplé à autre molécule qui est spontanément colorée ou devient aisément
Autre molécule usually fluorochromes (spontanément fluorescents) ou peroxydase (donne secondairement avec la para-aminobenzidine un précipité brun foncé)
Peut aussi utiliser anti-sérum pour amplifier signal (ex: avidine-biotine-peroxydase)
Ac coutent cher
Point technique à considerer pour immunofluorescence
Sections prep par congélation (diminue moins l’activité Ag et la colo est plus intense)
Ag solubles sont perdus
Fixation dans formaldéhyde rarement utilisée cuz le procédé et circulation subséquente endommage la réactivité Ag
Points techniques: déshydratation et fixation par agents chimiques
Déshydratation déplie et change la solubilité des PR-
Fixation chimique dénature et stabilise PR- soit par coag, formation de composés additifs ou par combinaison des 2
Fixateurs coagulants et non additifs permettent une bonne pénétration de Ac et ne bloquent pas les déterminants immunoréactifs (use formol pareil)
Doit fixer puisque Ag = PR- (soluble en solution aqueuse)
Quand la congélation necessaire?
Plusieurs Ag (surtout marqueur GB de surface) ne survivent pas au traitement paraffine ou fixation avec agents chimiques additifs
Vimentine
Situé surtout dans le tissu conjonctif (fibroblastes, macrophages, Sertoli, mélanocyte, lymphs, podocytes)
Présence indique sarcome musculaire
Ag facilement détruit
Formaline détruit –> alcool préférable
CQ de fixation
Si trop fixé, vimentine sera moins intense
Si juste right devrait still avoir vimentine
Fixateurs: acétone et alcool
coag
non additif
Fixateurs: formaldéhyde
non coag, additif
8-12h fixation –> 24h max
Liens qui cachent les sites Ag
Méthode de récupération des épitopes so moins besoin de watcher le temps dans le fixateur
Formaldéhyde-zinc: préserve mieux réactivité immuno
Fixateurs: chlorure mercurique
coag, additif
B5
B5
Bon pour démonstration Ag intracytoplasmiques
Bx de ganglions lymphatiques pour meilleure préservation des détails cytologiques et augmentation de la réactivité immunologique
Ig de surface membranaires sont moins bien démontrées
Pas bon pour Ag non lymphoide: colo de fond, artéfact cytoplasmique (dans cellules tumorales)
Ne peut pas utiliser pour fixation tumeurs origine inconnue
Fixateurs: bouin
Bonne préservation Ag
Fixateurs: Zenker
Bonne préservation Ag
Méthanol-Carnoy
Fixateur base alcool
Bonne préservation Ag
Glutaraldéhyde
à éviter
préserve bien morpho tissulaire
bloque déterminants Ag de façon irréversible
Circulation
Fixation doit être complète
Paraffine dommage Ag (bas point d’ébulition)
Microtomie
Eau distillée propre seulement
Pas d’adhésif ou de substance ajoutée au bain
Port de gants (particules de peau)
Pas de plis dans le tissu –> provoque artéfacts
Récupération des Ag
Quand use formol par exemple (excès de liaisons interPR-) –> Ac n’ont pas accès –> faux négatifs
2 méthodes: chaleur et aux Z (livre p.282)
Avantages de récupération
- peut plus diluer Ac (coutent cher)
- peut détecter Ag usually non détectables
- Rxn plus intense avec temps incubation plus court
- colo plus uniforme
- colo de fond diminuée
- consistance des colo (répétables)
- meilleure standardisation
Méthode de visualisation: immunofluorescence
Ac conjugué à un fluorochrome (fluoroscéine –> vert, rhodamine –> rouge/orange)
Combine sensibilité, spécificité et simplicité
Surtout pour Bx de peau et rein (coupes par congélation préférable)
Méthode de visualisation: immunoperoxydase (immunohistochimie enzymatique)
+ d’étapes que immunofluo
Principle similaire
Ac couplé avec Z
Z + substrat + chromogène = système qui permet de visualiser localisation Ac sur tissu –> développement d’une couleur
immunoperoxydase: types d’Z
- Phosphatase alcaline
- Bêta galactosidase
- Glucose oxydase
- Peroxydase de radis fort
immunoperoxydase: chromogène
Donneur d’électrons
Produit une colo suite à oxydation
2 sortes: DAB et AEC
DAB
Insoluble dans alcool et xylol (xylène) –> souvent pour ca qu’on utilise
Brun
SUPER cancérigène
AEC
Soluble dans alcool (utilisé seulement un milieu de montage aqueux)
Colo rouge
Cancérigène
Méthode directe
Ac spécificité connue pour ID Ag dans tissu
Ac couplé à fluorochrome
Ac conjugué mis en contact avec section de tissu
Complexe Ag-Ac si Ag présent
Surtout pour spécimens de peau et rein
Immunofluorescence = méthode directe
Fluorochromes: fluoroscéine (vert) et rhodamine (orangé-rouge)
Méthode directe: avantages
Rapide
Easy
Sections 2 microns préférables, mais 5-6 workent
Méthode de choix pour détection Ig sur coupe de peau
Méthode directe: désavantages
Besoin de sections congelées Microscope fluo usually necessaire Pas très sensible Auto-fluo des ac. nucléiques = problème Preparations pas permanentes (doit garder dans endroit frais et sombre
Méthode indirecte
+ spécifiques que méthode directe
Voir photos p. 231 pour visualiser
1er Ac: spécifique à l’Ag
2em Ac: spécifique au 1er Ac et couplé à un marqueur
Méthode de visualisation usually immunofluorescence
Méthode indirecte utilisée dans 2 cas suivants
- Ac antinucléaires
Sérum Pt ajouté aux sections de tissus contenant Ag connu pour déterminer si le Pt possède Ac
Ac marqué (Ig anti-humain) utilisé pour détecter Ac du Pt qui serait fixé - Tout simplement any situation que tu use 2 ou 3 Ac pour détecter l’Ag dans le tissu
2 types de méthode indirecte
- 2 étapes
- 1er Ac –> non-marqué, mais spécifique à Ag
- 2em Ac –> marqué et dirigé contre 1er Ac - 3 étapes
- 1er Ac –> non-marqué, mais spécifique à Ag
- 2em et 3em Ac –> marqués et dirigés contre 1er et 2em Ac
- intensifie couleur
- méthode 2X plus longue
Méthode du complexe immun enzymatique soluble
p. 284
3 étapes:
- 1er Ac –> lie Ag du tissu, provient du lapin
- 2em Ac (AKA Ac de liaison) –> lie 1er Ac, provient de souris
- Complexe Z-antiZ –> lie 2em Ac, provient de lapin
2em Ac fait lien entre 1er Ac et complexe Z-antiZ –> 1er Ac et complexe Z-antiZ doivent alors venir du même animal (pour que liaison se fasse)
Ajoute ensuite substrat pour développer colo (faire réagir les Z)
Méthodes plus communes:
- PAP –> peroxydase- antiperoxidase
- Phosphatase alcaline - antiphosphatase alcaline
Méthode Avidine-Biotine (Avidin-Biotin Complex ou ABC)
2 méthodes: ABC (plus fréquente) et LAB (labeled Avidin-Biotin)
Voir p. 233 pour visualiser (photo à gauche est ca décrit dans la procédure but chepas cos qu’est la photo à droite… méthode LAB maybe?)
Avidine
PR-
4 sous-unités –> chaqu’un possède 1 site de liaison
Source: blanc d’oeuf (contient partie d’hydrate de carbone) ou streptomycetes
Très grande affinité pour vitamine biotine (about 1 million de fois plus fort que affinité d’un Ac pour son Ag)
Biotine
Vitamine
Dans jaune d’oeuf
Forte affinité pour avidine
3 réactifs
- 1er Ac –> lie Ac recherché –> très spécifique
- 2em Ac conjugué à biotine –> peut lier 1er Ac et complexe ABC
- Complexe ABC –> molécule avidine et biotine: contient des sites libres pour la biotine since avidine peut lier 4 molécules de biotine –> molécule ABC liée à un Z
Procédure ABC
- déparaffinage, éclaircissement, hydratation
- Traitement lames avec H2O2 + méthanol: bloque activité endogène de peroxydase dans les tissus –> surtout tissus avec bcp de sang
- Solution protéique de bloquage (universal blocker): blocage/remplis des sites chargées (collagène et conjonctif) –> ne veut pas que Ac fixe –> doit venir du même animal que 2em Ac pour éviter que 2em Ac fixe solution protéique (sinon: bruit de fond, colo non spécifique)
- 1er Ac
- incubation et lavage
- 2em Ac
- incubation et lavage
- Réactif ABC: complexe avidine-biotine couplé à Z (peroxydase)
- incubation et lavage
- DAB: formation d’un composé coloré
- incubation et lavage
- contre-colo: hématoxyline de Mayer (pas d’alcool)
