Enrobage et Microtomie Flashcards
But de l’enrobage
Support externe
Meilleure conservation du tissu
Production de rubans
Choix du type de paraffine utilisé
Meme que le media utilisé pour imprégnation
Doit considérer: point de fusion et la qualité de la fabrication de ruban
Paraffine doit être refroidie rapidement pour une cristallisation uniforme (meilleure élasticité et résistance)
Point de fusion élevé
Meilleur support pour tissus durs
Plus facile sections minces
Rubans plus difficile à faire
Point de fusion bas
Support pour tissus durs moins bon
Section minces plus difficiles à obtenir
Ruban plus facile à faire
Pour un bon enrobage doit considérer
Disposition des pièces dans le moule
Orientation des pièces dans le moule
Surface de coupe
Disposition des pièces dans le moule: 1 pièce de tissu
Doit être au centre sinon ruban difficile à faire (pas assez de paraffine autour de la pièce)
Disposition des pièces dans le moule: 2 ou 3 pièces de tissu dans le même moule
Unes à côté des autres en diagonal (diminue la compression lors de la coupe)
Laisser une espace entre les pièces
Disposition des pièces dans le moule: Kyste
Coupé en 2 lors de l’examen macroscopique
Surface coupée doit être en contact avec le fond du moule
Disposition des pièces dans le moule: Fragments plats
Tout le fragment en contact avec le fond du moule
Orientation des pièces dans le moule: pièce non parallèle
Côtés non parallèles
Le plus petit côté vers le bas
Couteau commencera à couper une petite portion au début
Moins de compression
Orientation des pièces dans le moule: Structure tubulaire
Ex: canaux déférents, veines, artères, trompes de Fallope
Couteau du microtome doit couper au travers la lumière de la structure
Orientation des pièces dans le moule: Surface épithéliale
Ex: peau, intestin
Portion plane dans le fond du moule
Épithélium vers le dessus du bloc (coupé en dernier)
Minimise la pression et distorsion de l’épithélium
Orientation des pièces dans le moule: Plusieurs fragments (avec surface épithéliale ou non
Orientés dans le même sens
Épithélium dans le haut
Disposition oblique
Orientation des pièces dans le moule: encre de Chine
Surface marquée doit être visible
Certains cas surface marquée et non marquée doivent être visibles
Orientation dans le même sens
Précaution particulières lors de l’enrobage
- Orientation du spécimen dans le moule (facilite coupe, meilleure visibilité au microscope), dépend du spécimen
- Position du spécimen dans le moule (ne doit pas toucher les côtés du moule), centrer le spécimen
- Déformation du spécimen (ne pas serrer ou compresser le tissu, chauffe un peu les pinces)
- Surface de coupe (doit être celle qui se trouve en contact avec le fond du moule)
- ID bloc
- Durcissement de la paraffine (plus rapidement possible)
Effets d’un mauvais enrobage: orientation
Erreur la plus fréquente
Doit refondre le bloc, réorienter, réinclure
Effets d’un mauvais enrobage: Refroidissement du bloc
Trop lent: cristallisation irrégulière, nuit à la coupe
Trop vite: présence de paraffine entre tissu et moule (trop de rétraction), bloc à surface concave
Effets d’un mauvais enrobage: Tissu trop froid
Paraffine dans tissu solidifie pas en même temps que celle dans le bloc (artéfact d’enrobage ou artéfact de couches d’inclusion)
- Formation de halo autour de la pièce
- Tissu détache pendant la coupe
Effets d’un mauvais enrobage: Épaisseur de paraffine
Pas assez sur le dos du bloc (tissu découvert pendant refroidissement)
Effets d’un mauvais enrobage: Attend trop longtemps
Avant de mettre tissu dans bloc
- couche de paraffine durcit au fond du moule
- plusieurs couches se superposent (artéfact de couches d’inclusion)
- rabotage inutile
Problème: tissu apparence molle
Apparence: Voit à la station d’enrobage, centre de la pièce mal circulé (texture molle)
Cause: section trop épaisse qui cause la compression entre le dessus et dessous de la cassette (liquides ne pénètrent pas tout le tissu)
Prévention: coupe mince, fixe bien, pas de problème mécanique
Retrait: A) Si vu à la station d'enrobage: couper fragment plus mince, remettre dans cassette et traiter 1. xylène (enlève paraffine) 2. Tetrahydrofurane (déshydrate/éclaircit) 3. xylène 4. paraffine (imprégnation) 5. enrobe B) si fixation imcomplète 1. fond paraffine 2. mettre dans circulateur 3. procédure de nettoyage du circulateur 4. manuellement dans alcool 95% et 70% 5. formol 6. circuler avec prochaine batch
Problème: orientation incorrecte
Apparence: structures essentielles difficiles ou impossibles à visualiser à la microscopie
Cause: mauvaise orientation du tissu
Prévention: Marquer (incision) la surface à être enrober vers le haut, instruction sur cassette ou feuille de travail et ouvrir les spécimens du GI tract (ne rouleront pas)
Problème: contamination
Apparence: voit à la microscopie whatever qui contamine
Cause: transfert de fragments de tissu d’un spécimen à l’autre
Prévention: nettoyer pinces et ouvrir une seule cassette à la fois
Problème: Tissus pas enrobés au même niveau
Apparence: atteint pas toute la surface en même temps à la microtome
Cause: pas assez aplani dans le fond du moule ou plusieurs fragments enrobés à des niveaux différents
Prévention: pression ferme et uniforme sur le tissu, garder la paraffine fondue dans le fond du moule, travailler rapidement
Problème: morceaux manquants
Apparence: absence de fragments
Cause: manque d’attention, erreur à la salle de coupe
Prévention: noter # de fragments, vérifier intérieur de la cassette avant de jeter
Épaisseur de coupe
4 microm (routine) 2 microm (imprégnation Ag) 6 microm (rouge congo)
Microtome à glissière
Couteau mobile et déplace horizontal
Tissus inclus dans celluloidine
Coupes sur grandes surfaces
Pas de coupes sériées
Microtome à balancier
Peu utilisé
Couteau fixe
Objet déplace
Pour petites pièces
Microtome coupe ultramince
ME
Biseau du couteau en verre ou diamant
Pour très petites pièces seulement
Microtome rotatif
Microtome de Minot Plus populaire Rotatif (roue motrice) Couteau fixe Déplacement du porte-objet: avancement (horizontal) d'une épaisseur précise et haut-bas Biseau vers le haut (dangereux) Stable (pesant) Facile d'entretien Bon pour coupe sériée Pas bon pour gros blocs
Microtome-cryostat
Tissu congelé
Pour STAT, Z, fluo
Souvent même principe que rotatif, mais dans enceinte à -20 oC
Impossible de faire des rubans
Couteaux
Jetables les plus populaires même si atteignent TP plus rapidement, doivent être dans porte-lame pour éviter vibrations
Bouts coupants des jetables souvent recouvert de chrome ou platine pour augmenter résistance et durabilité
Recouvrement de téflon pour cryotome (diminue friction)
Biplan en coin: profile C, lames jetables
Angle de couteau
- Angle du biseau (27-32), dépend du couteau
2. Angle de structure (15), 2 facettes du couteau, dépend du couteau
Angle de travail
- Angle de dégagement (3-8): formé par facette inférieure du biseau et surface du bloc
si pas bon: compression du tissu, pas de ruban - Angle d’inclinaison AKA angle d’attaque (15): formé par facette inférieure du couteau et surface du bloc
Angle de dégagement trop grand
Grattage du bloc Pas de ruban Coupes s'enroulent Coupes se déchirent Chattering Ondulations
Angle de dégagement trop petit
Coupes comprimées
Coupes plissées
Coupes décollent du rasoir et collent sur bloc
Coupes épaisseur inégales: alterne mince-épais
Problème microtomie: ruban incurvé
causes: 1. bords horizontaux du bloc pas parallèles 2. bord du bas bloc pas parallèle au bord couteau 3. surplus de paraffine sur un coté 4. consistance du tissu varie 5. couteau émoussé correction: 1. aligner bords bloc 2. fix it 3. enlève surplus 4. refroidir uniformément 5. déplace ou remplace couteau
Problème microtomie: surface du bloc pas sectionnée également
cause: porte bloc ou bloc pas ajusté parallèlement au couteau, gaspillage de tissu
correction: s’assurer que parallèle
Problème microtomie: trous dans section
cause: 1. attaque bloc trop agressive 2. déshydratation excessive 3. air dans tissu (ex: poumon) 4. imprégnation ou circulation non complète correction: 1. doucement 2. trempe dans bain eau glacé avant de sectionner 3. ré-imprégner 4. ré-imprégner ou re-circuler
Problème microtomie: pas de ruban formé
cause: 1. couteau émoussé 2. paraffine trop dure 3. angle dégag. trop grand 4. TP trop basse 5. débris sur couteau correction: 1. déplace ou change 2. ré-inclure paraffine point fusion plus bas 3. ajuster 4. ajuster 5. nettoyer lame avec xylène
Problème microtomie: sections adhèrent au bloc
cause:
1. couteau émousse
2. angle dégag. trop petit
3. TP trop élevée
4. paraffine trop molle
correction:
1. déplace ou change
2. augmente
3. ajuste
4. utilise paraffine plus dure
Autres Problème microtomie
voir p. 99, 102-104 dans notes
Rabotage
TP
Enlève excès de paraffine qui recouvre la surface de coupe du tissu
Peut faire avant de mettre tissus sur glace
Coupe au hasard
Surface 100% (toute surface du tissu doit être visible)
Coupe niveaux
2 ou 3 niveau
Souvent pour moyennes et petites pièces
2 niveaux
1 –> 85%
2 –> 100%
3 niveaux
1 –> 75%
2 –> 90%
3 –> 100%
Coupe sériée
Délicat
Sauve toute les sections, mêmes celles qui ne sont pas belles
Numérotées dans ordre de coupe
Pour petites biopsies
Pour avoir imagne cellulaire du tissu niveau par niveau
Précautions pour la coupe sériée
Use même microtome, oriente même façon, nouvelles lame, pression égale, ne pas arrêter formation du ruban mi-chemin
Facteurs qui influencent la microtomie
p. 103
Aspects a considérer
- angle de dégagement
- ajustement mécanique
- couteau-lame
- tissu (décal, refroidit, etc.)
- vitesse de coupe
- température
