Prepareringstekniker för elektronmikroskopi Flashcards
Vilka krav måste ställas på vårt preparat för att det ska kunna mikroskoperas i TEM?
- Vakuum → dehydrering
- e- transmission → tunnsnittning
- e- osynlig → kontrastering
- Högspänning → stabilitet
Hur prepareras vävnad för TEM?
- Fixering
- Dehydrering
- Inbäddning
- Snittning
- Kontrastering
- Mikroskopering
Vilken fysikalisk fixering görs (TEM)?
Frysning (cryo), mikrovågsbehandling
Vilka krav finns för den kemiska fixeringen (TEM)?
- Lämplig jonsammansättning
- Lämplig osmolaritet
- Förmåga att behålla konstant pH-värde
Vad är dubbelfixering, vilka sorts bitar används det på och hur går det till?
Används vid små vävnadsbitar (ca 1 mm)
- Primärfixering med formaldehyd, glutaraldehyd
Vanligt med kombinationsfixering bestående av båda aldehyderna
- Postfixering med osmiumtetraoxid (tungmetall)
“En bloc”-behandling med t.ex. uranylacetat, garvsyra
Krav för inbäddning av preparat för TEM?
- Låg viskositet, lättflytande
- Uniform polymerisering (härdning)
- Ingen volymförändring
- Lämplig hårdhet
- Stabil och jämn kvalitet
Vad bäddas preparaten in med (TEM)?
Härdplast - epoxyplast eller akrylatplats
För- och nackdel med epoxyplast?
Fördel - krymper 2%, jämn polymerisering, stabil i elektronstrålen
Nackdel - hydrofob, högviskös, polymeriserar i värme (60ºC)
För- och nackdel med akrylatplast?
Fördel - hydrofil, lågviskös, polymeriserar både i rumstemp. / minustemp, UV-ljus
Nackdel - krymper 10-20%, ojämn polymerisering, mindre stabil i elekronstrålen
Vad sker snittning med (TEM)?
Ultramikrotom / ultrotom
Glas- eller diamantkniv
Hur går kontrastering till och varför görs det?
Varför? Ökar effekten av den elastiska avlänkningen - scattering, alltså det som skapar bild
Hur? Grids med ultratunna snitt utsätts för lösningar av tungmetaller, ex. uranyl, bly, wolfram
Vad dehydreras TEM-preparat med?
Etanol
Snittning av TEM-preparat?
- “Tjocksnitt”, ca 1 µm
- Tunnsnitt på grid, ca 60 nm
Vad är konduktiv montering och vad händer om det inte används?
Det innebär att preparatet sitter fast på metallen (är jordat).
Annars kan man få överslag i mikroskopet
Vad beläggs SEM-preparatets yta med och varför?
Beläggs ofta med tungmetaller, för att öka den sekundära strålningen
Hur går vävnadspreparering till (SEM)?
- Primärfixering: aldehydfixering
-
Postfixering enl. OTOTO-metod = upprepad osmifiering:
- Osmium(VIII)tetroxid
- Thiocarbohydrazide
- Osmium(VIII)tetroxid
- Thiocarbohydrazide
- Osmium(VIII)tetroxid
- Dehydrering: stigande konc etanol (70-100%)
- Torkning: Hexametyldisilazande; t-butanol-sublimation; critical point drying; frystorkning
- Sputtercoating - tunn film av Au, Cr, Pd
Skillnad mellan TEM och SEM?
Vad är pre-embedding?
Immunoinkubering innan postfixering, dehydrering och inbäddning
Vad är post-embedding?
Immunoinkubering görs på plast-inbäddade snitt (akrylatplast)
Vad är kryosnittning?
- Görs vid -100ºC till -120ºC
- Snitt immunoinkuberas på grids
- Kontrasteras med uranyl
- Snitten inbäddas i metylcellulosa
Vad är PLT-metoden (post-embedding)?
PLT - Progressive Lowering of Temperature
- Kemisk “lättfixering”
- Dehydrering med etanol under progressiv temperatursänkning (-30ºC till -50ºC)
- Inbäddning i akrylatplast vid -30ºC till -50ºC
- Polymerisering med UV-ljus
- Snittning i rumstemperatur
Hur går detektering till vid immunocytokemi för TEM?
Sker med hjälp av guldmärkta antikroppar, där guldstorleken är 1-25 nm
Vad är problemet med immunocytokemi för TEM?
Antigen-epitoperna förstörs av traditionell TEM-preparering. Det är en kompromiss mellan att behålla antigeniciteten och god morfologi. Krävs god planering för att bestämma metod.
Vilka metoder finns för immunocytokemi för TEM?
Pre-embedding, post-embedding, kryosnittning
Varför kombinationsfixerar man med både glutaraldehyd och formaldehyd vid TEM?
Användningen av en aldehydblandning kan kompensera för nackdelarna som finns hos glutaraldehyd (långsam penentreringshastighet) och formaldehyd (mindre stabil fixering) när de appliceras individuellt
