Immunologisk metodik Flashcards
Vad har immunohistokemi (IHC) för användningsområden?
- Diagnostik av immunologiska sjukdomar
- Diagnostik-klassificering av tumörer
- Påvisning av mikroorganismer
Vad är immunologisk metodik?
Analysmetoder som utnyttjar olika antikorppars specifika förmåga att fästa till olika epitoper (antigena determinanter) på ett antigen
Olika antikroppar fäster på olika epitoper. Därefter visualiseras fästa antikroppar
Vilka immunologiska metoder finns? Vad analyserar de?
- Immunohistokemi - vävnad
- Immunocytokemi - celler
- Immunoprecipitation - nercentrifugerade celler (ett koagel)
- ELISA (Enzyme-linked Immunoabsorbent Assay)
- RIA (Radioactive Immune Assay)
- Western blot, Northern blot, Southern Blot - proteiner
- Dot blot, Slot blot - DNA/RNA separation
- FACS (Flödescytometri)
Vad är ett antigen?
En för organismen främmande molekyl som framkallar en reaktion hos immunförsvaret. Denna reaktion leder till nybildning av antikroppar och kan användas till deras framställning
Vad är ett epitop?
Den del av ett antigen dit en specifik antikropp binder med en kort aminosyrasekvens
(epitop = antigen-determinant)
Exempel på antigen?
- Proteiner - proteinföreningar
- Kolhydrate
- Lipider
- Haptener (ex. tungmetall + protein)
Vad är en antikropp?
Ett glykoprotein (makromolekyl bestående av protein och kolhydrat) som produceras i en organsim vid antigenstimulering
Vad heter de 5 olika klasserna av antikroppar?
- IgA
- IgD
- IgE
- IgG
- IgM
Hur ser en antikropp ut (vad består den av och vad heter dess olika delar)?
- Består av 4 kedjor; 2 tunga och 2 lätta
Vad sammanlänkas antikroppens kedjor med?
Med disulfidbryggor
Var ligger Fab och Fc-domänen på en antikropp och vad står förkortningarna för?
- Fab - fragment antigenbindande, är hypervariabel
- Fc - fragment kristalliserbar
Vad är polyklonala antikroppar för något, och var härstammar de ifrån?
- En heterogen samling (flera olika antikroppar) riktad mot flera olika epitoper
- Kan affinitetsrenas
- Härstammar från flera cell-linjer
Vad är monoklonala antikroppar för något, och var härstammar de ifrån?
- Identiska antikroppar riktade mot EN epitop
- Kan binda till endast en typ av epitop
- “Mest önskvärt” vid biokemiska tekniker
- Härstammar från EN enda cell-linje (klon)
Var produceras antikroppar, och hur går produktionen till?
- Bildas i B-lymfocyter
- B-celler har membranbundna antikroppar bundna till sin yta
- Främmande antigen träffar antikropp på B-cellen, som stimuleras till delning samt tillverkning och utsöndring av fler anti-kroppar
Hur binder antikroppar till antigenen?
- Antigen-antikroppsreaktion
- Affinitet, aviditet
- Specificitet, korsreaktion
Antikroppens “binding site” känner igen en epitop på antigenet och binder sig dit (antigen-antikroppsreaktion). Hur binder den?
- Van der Waal’s krafter
- Vätebindningar
- Elektrostatiska interaktioner
- Hydrofobiska krafter
Vad är affinitet?
- Styrkan i reaktionen mellan en antigen epitop och en antikropp (“hur väl den binder in / passar in”)
- Hur väl antigenets epitoper formmässigt passar in i antikroppens “binding site”
Vad är aviditet?
- Sammanlagda styrkan mellan en antikropps bindningsställen och ett antigen
- Hur många “binding sites” på en antikropp som binder till samma typ av epitop. Aviditeten är beroende av den sammanlagda affiniteten mellan antikroppars “binding site” och epitopen
Vad är specificitet?
En enskild antikropps förmåga att binda till endast en specifik antigen epitop
Vad är en korsreaktion?
En enskild antikropps förmåga att binda till fler än en antigen epitop
Vad är skillnaden mellan specifik och ospecifik inbindning?
- Specifik = bindning mellan Ak-Ag, till avsedd epitop
- Ospecifik = bindning beror ej på Ak-Ag reaktion
Ge exempel på ospecifik bindning
- Endogent peroxidas / fosfatas
- Endogent biotin
- Autofluorscens
- Komplementmedierad bindning
Vad är ett endogent ämne?
Ett kroppseget ämne
Vad inhiberas endogent peroxidas med?
Väteperoxidlösning (H2O2)
* “Vart finns” endogent peroxidas?
- Myeloida celler
- Hemoproteiner
- Myoglobin
Vad inhiberas endogent biotin med?
Avidin och biotinlösning
Vart finns endogent biotin?
- Mitokondrier
- Lever
- Binjure
- Spottkörtel
- Karcinomer (bröst, colon)
Vilka markörer används på antikroppar (för detektion)?
- Enzymer (ex. peroxidas, alkaliskt fosfatas)
- Fluorochromer (ex. rodamin, FITC)
- Metaller (ex. guld, järn)
- Isotoper
Vad står ELISA för?
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Vad är principen för ELISA?
- Antigen binds till brunnarnas väggar
- Prov tillsäts
- Provets antikroppar reagerar med brunnarnas antigen
Vad står FACS för?
Fluorescence Activated Cell-Sorting
Vad är principen för FACS?
- Celler i lösning märks med fluorescerande antikroppar (och får laddning)
- Cellerna passerar en laser - separation (flödescytometri) /sortering utifrån storlek och grumlighet
- Fluorescensen mäts - mängd ljus motsvarar mängd celler av en viss typ (olika mönster för olika celler)
- Cellerna passerar laddade plattor och sorteras efter laddning
Vilka är stegen vid immunohistokemisk metod?
- Vävnad (snitt) / celler (glas eller suspension)
- Deparaffinering
- Rehydrering
- Antikropp tillsätts i ett eller flera steg
- “Framkallning” av färg
- Dehydrering
- Montering av täckglas
- Mikroskopering
Hur delas immunohistokemiska metoder in?
Efter hur många antikroppar som används
Direkt metod, två-stegs indirekt metod, tre-stegs indirekt metod
Hur namnges immunohistokemiska metoder?
Efter det enzym-immun-komplex som användes
Efter molekyler bundna till biotin
Ge exempel på immunohistokemiska metoder som namnges efter det enzym-immun-komplex som användes
PAP = peroxidase anti-peroxidase
APAAP = alkalisk phosphatase anti-alkalisk phosphatase
Ge exempel på immunohistokemiska metoder som namnges efter molekyler bundna till biotin
ABC = avidin/streptavidin-biotin-enzyme complex
LAB/LSAB = labelled avidin/labelled streptavidin-biotin
CAS = ABC-metod + catalyzed signal amplication
En vision = antikropp konjugerad med enzymmärkt dextranmolekyl
Vad är principen för ABC-metoden vid immunohistokemisk färgning?
Vad kan ett falskt positivt analyssvar bero på (IHC)?
Hur kan detta åtgärdas?
Antikroppen binder till fel eller flera olika epitoper - ev. behövs blockeras med serum
Förekomst av Ak-bindande endogent komponent - blockera med väteperoxid så endogent peroxidas blockeras
Vad kan ett falskt negativt svar bero på?
Prepareringen har förstört epitoperna
Maskerade eptioper
Glömt antikropparna eller för svag antikropps-koncentration
Paraffin kvar på snittet
Gamla lösningar
Vad gör man för att åtgärda ett falskt negativt svar som beror på maskerade epitoper?
Unmasking med retrieval buffer
Vilka typer av ELISA finns det?
Hur producerar man monoklonala, respektive polyklonala anikroppar?
Principerna för olika indirekta metoder - PAP, APAAP och ABC
