PCR mikrobiologi Flashcards
Hvorfor kan PCR være nyttig i mikrobiologi?
Kan se etter spesielle proteiner/gener hos andre arter enn vår egen dersom vi kjenner mikrobens arvemateriale.
Hvilken manuelle ekstraksjonsmetode er vanlig i mikrobiologi? Forklar prinsippet
Kokelysering.
- Bakterier i vekst på skål tas opp med øse og tilsettes lysisbuffer. Bufferinnhold varierer etter type bakterie, hva som skal til for å lysere den (noen lyseres kun vha vann, andre må ha enzymer gr eks. proteinkapsel)
- Varmeblokk 95 grader i 15min slik at bakterien lyseres og DNA/RNA blir fritt
- Sentrifuge (høy hastighet, kort tid) –> DNA/RNA i supernatant
Forklar prinsippet for ekstraksjon med magnetiske kuler
- Lysering av prøve med lyseringsbuffer for å tilgjengeliggjøre DNA/RNA
- Tilsetter kjemikalier som denaturerer proteiner som kan interferere med prøven (eks proteinase K for å bryte ned nukleoser)
- Tilsetter paramagnetiske kuler som bindes til DNA/RNA
- Bruker magnet til å trekke til seg kulene med DNA/RNA, slik at man kan vaske løsningen
- Tilsetter elueringsbuffer som gjør at kulene slipper DNA/RNA
Hva trenger man for å utføre PCR?
DNA/RNA templat
PCR-mix (primer, DNA polymerase, nukleotider, buffer/kofaktorer, probe (v/real time))
PCR-instrument
Hva er ulempen med konvensjonell PCR?
Det er ikke mulig å dokumentere om primerene er bundet til DNA før reaksjonen er ferdig
Hvordan fungerer SYBR green, FRET og TAQMAN probe? Hvilken brukes mest i mikrobiologi?
SYBR Green: Binder spesifikt til dobbelttrådet DNAm, men er ikke spesifikk for aktuell primer. Måles ved 530nm i elongeringsfasen.
FRET: 2 prober (origoer) merket med ulikt signal. Hybridiserer når de bindes til enkelttrådet DNA med en avstand på 1-5 baser. Mer spesifikk enn SYBR green siden det er 4 gensekvenser som MÅ passe for at man skal få signal, og man er derfor ganske sikre på at signal viser rett produkt.
TAQMAN-probe:
2 primere og en probe. Proben består av en bestemt DNA-sekvens, en reporter som er fluoriserende og en quencher. Reporteren gir ikke fluoriserende lys så lenge den er bundet til quencheren. Denne bindingen brytes når DNA-polymerase når probe når den transkriberer sekvensen.
Hvorfor utføres smeltepunktsanalyse? Hvordan skiller analysen ulike sekvenser fra hverandre?
Kontroll for at riktig del av DNA er amplifisert. Kan også avdekke primer-dimer.
Smeltepunktet til PCR-produktene vil variere med størrelsen på produktene, altså antall og type baser i sekvensen. En smeltepunktsanalyse vil kunne skille produkter med bare 1 basepar i forskjell fra hverandre.
Hva er Ct-verdi og threshold?
Syklusen hvor PCR-kurven krysser threshold, som er en terskel som definerer når signalstyrken blir signifikant forskjellig fra bakgrunnssignalet (i den eksponentielle fasen). Ct-verdien er omvendt proporsjonal med mengden DNA i prøven, da mer mål-DNA i prøven vil gi eksponentiell vekst raskere.
Hva er RT-PCR, og når er dette nyttig?
Revers transkriptase PCR, som benyttes når prøvematerialet er RNA, og ikke DNA. cDNA dannes fra mRNA ved hjelp av revers transkriptase, og benyttes som templat i PCR-reaksjonen.
Noen bakterier og virus har RNA og ikke DNA, og noen har begge deler.
Hva er multiplex PCR? Hva kan være problematisk?
Multiplex betegner en PCR-analyse hvor man detekterer flere målgen i samme analyse. For eksempel vanlig i deteksjon av influensa A og B. Det bør velges prober med ganske ulik avlesningsbølgelengde for å hindre at feil målgen avleses under feil bølgelengde/probe.
Hvordan kan man undersøke en PCR-metodes spesifisitet?
Primeren må binde til noe som er unikt for den mikroben vi leter etter. Dette kan sjekkes ved å søke opp basesekvensen i en database (eks BLAST). Jo flere ting som kommer opp ved søk på sekvensen, jo mindre spesifikk er primeren.
Det er viktig å undersøke også hva som dukker opp på listen. Primerbinding til andre ting i det humane genomet bør unngås, men dersom det har felles sekvens med f.eks. en blomst, vil det sannsynligvis ikke være et problem da dette ikke vil finnes i prøven uansett, og det er liten sannsynlighet for art prøven kontamineres med DNA fra en blomst.
Hvordan undersøles en PCR-metodes sensitivitet?
Hvor lite av mikroben vi leter etter som må til for at metoden skal klare å detektere mikroben.
Dette undersøkes ved hjelp av fortynningsrekker.
Hvordan kan annealingtemperatur, primerkonsentrasjon, primerdesign, tid for hvert steg, antall sykluser, MgCl og UNG påvirke PCR-reaksjonen?
Annealingtemp: For lav temperatur vil kunne gi økt uspesifikk binding, og for høy temperatur vil kunne hindre binding. Må tilpasses hver enkelt rx
Primerkonsentrasjon: For mye primer: økt uspesifikk binding. For lite primer: primeren bli den begrensende reaktanten i reaksjonen (vil brukes opp).
Primerdesign: komplementære sekvenser kan gi primer-dimer og hirpins.
Tid for hvert steg: Må tilpasses antallet og type baser i målselkvensen slik at reaksjonene som skal skje i hvert trinn rekker å skje. Det vil gå raskere med korte strukturer.
Antall sykluser: Mange nok til at man oppnår Ct, men ikke for mange da dette bare vil koste tid og penger da det ikke vil gi et bedre resultat å kjøre «for mange» sykluser. Vanlig antall er ca 40.
MgCl: For mye kan gi uspesifikk binding, men MgCl er nødvendig for DNA-polymerase
UNG; benyttes for å hindre kontaminering, men kan degradere PCR-produktene
Hva er effektivitet? Hvor stor effektivitet ønskes?
En effektivitet på 100% forteller at PCR-produktet dobles i eksponentiell fase. Man etterstreber en effektivitet på 90-110%.
