NGS prøvegang Flashcards
Hvilke 9 trinn består bibliotekspreparering av?
Tagmentering, rensing, PCR, rensing, sammenslåing av prøver, Target enrichment, hybridisering av oligoer, capture, amplifisering (PCR), rensing.
1: Tagmentering av genomisk DNA
DNA tagges (merkes) og kuttes i en og samme reaksjon. Fragmenter på ca 350bp, tagges med adaptere som er viktig for senere amplifisering. Et vanlig tagmenteringskompleks er kulebasert, og kutter DNA i samme reaksjonen.
Det er viktig å bruke DNA i overskudd, for å få samme DNA-konsentrasjon i hver prøve. Ubundet DNA fjernes.
2: Rensing etter tagmentering
Under tagmenteringen vil man få noen fragmenter som er kortere enn 350bp, noen som er lengre, og noen som ikke får på adaptere på hver side. Disse må renses vekk.
Dette gjøres ved å sette prøvene på et magnetbrett.
3: PCR (amplifisering med index-merking)
Nå har vi tagmentert genomisk DNA, men av ganske få kopier, så det på oppamplifiseres.
Primerene som tilsettes i PCR-reaksjonen består av 3 deler, og fester seg til adaptorene på hver side av DNA-fragmentet som ble påsatt under tagmenteringen.
Primer del 1: Sekvems komplementær til adaptorene på DNA-fragmentene (nødvendig for utførelse av PCR-reaksjonen)
Primer del 2: Sekvens som gir unik identitet til hver prøve (index). Muliggjør identifisering av hvilken pasient DNAet kommer fra.
Primer del 3: Sekvens komplementær til oligoene på flowcellen, som brukes til selve sekvenseringen
Steg 4: Rensing av amplifisert tagmentert DNA
Ønsker bare å ta vare på DNA-fragmenter på ca 350bp. Fjerner for lange og korte fragmenter i et totrinns magnet-kulebasert rensetrinn. I det første trinnet fjernes de lange fragmentene, i det andre trinnet fjernes de små fragmentene.
Kontrollerer at man bare har igjen fragmenter på ca 350bp vha et chipbasert kapillærelektroforese-system.
Steg 5: Sammenslåing av prøver (multiplexing)
Siden alle prøvene er unikt merket, kan de slås sammen. Slår sammen 12 og 12 prøver (12-plexer). Viktig at alle prøver som slås sammen har lik DNA-mengde, måler derfor konsentrasjon av prøvene før sammenslåing.
Steg 6: Hybridisering av oligoer
Tilsetter oligoer med sekvenser som er komplementære med sekvenser i de genene vi ønsker å gå videre med, Oligoene er merket med biotin, og vil hybridisere (binde seg) med de delene av biblioteker vi ønsker å gå videre med.
Siden oligoene er enkelttrådet, må DNA denatureres slik at oligoene kan binde til enkelttrådet DNA.
Det brukes mange oligoer per gen, antallet avhenger av størrelsen på genet.
Dette steget gjøres over natt for best resultat, men kan også gjøres på noen timer.
Steg 7: Capture
Drar ut hybridiserte oligoer bundet til fragmenter vi ønsker å gå videre med. Til dette benytter vi magnetiske kuler med streptavidin, som binder veldig godt til biotin. Det er biotin på oligoene. Prøvene settes på et magnetbrett, og pipetterer vekk all væske med ubundet DNA.
Steg 8: Amplifisering av enriched bibliotek med PCR
Nå har vi kun DNA-fragmenter med gener vi ønsker å gå videre med. Konsentrasjonen økes ved en siste PCR-reaksjon.
Steg 9: Rensing av Amplifisert enriched bibliotek
Renser ved hjelp av magnetiske kuler og måler DNA-konsentrasjonen i alle 12´plexene. Gjennomsnittlig lengde på bibliotekene måles, for å se at vi har amplifisert opp rett fragmentlengde (ca 350bp). 12´plexene blir slått sammen i en 48´plex, og det er klart for sekvensering.
Hva er de to hovedstegene i sekvenseringen?
Cluster generation og sequencing by synthesis
Hva er formålet med cluster generation, og hvordan utføres det?
Formålet er å oppnå høyt nok lyssignal under sekvenseringen. Uten cluster generation vil ikke signalert være godt nok. Hvert cluster er en klon fra ett enkelttrådet DNA.
- Hybridisering; enkelttrådet DNA binder til oligo på flowcellen
- Komplementær tråd dannes vha polymerase
- Original DNA-tråd vaskes vekk
- Bro-amplifisering lar cellene amplifiseres klonalt, polymerase lager komplementær tråd. Da sitter man med en forward og en revers «strand».
- Bro-amplifisering gjentas mange ganger til man har høyt nok signal
- Reverse «strands» kuttes av og vaskes vekk, slik at man bare står igjen med forward «strands» (sense-tråden).
Hvordan gjøres sequencing by synthesis?
Skjer gjennom to reads. Read 1 for sensetråden, og read 2 for reverstråden. 1 og 1 base settes på, og det tas et nytt bilde for hver base som settes på. Signalene hver base gir, forteller oss hvilken base det er som er satt på.
Hvordan er for høy DNA-konsentrasjon problematisk ved cluster generation?
Clusterene «smelter» sammen, de store cluster«klattene» oppfattes som én cluster av instrumentet, og antallet clustere blir underestimert. Dette er viktig å unngå da én kjøring med instrumentet fort koster 50 000,-
Hva inngår i pipelinen ved databehandling etter NGS?
Alignment, variant calling og annotering
Hva er alignment? Hvilke filer genereres?
Readsene mappes etter hvor på genet de hører hjemme. Til dette benyttes en referansesekvens, som er satt sammen av sekvenser fra 10 ulike personer. Slike referansesekvenser oppdateres jevnlig. Alignment fungerer ved at reads som ligner hverandre, vil mappes i samme område.
Fra alignment-mappingen genereres to filer; SAM og BAM. Dette er ganske kompliserte filer. BAM-filen er en binær, komprimert versjon av SAM, mens SAM inneholder leselig informasjon fra Alignment-mappingen. BAM kan viasualiseres via et dataprogram.
Hva er variant calling? Hvilken fil genereres?
I dette trinnet er vi interesserte i å detektere alle områder med varianter, som er steder hvor readsene avviker fra referansesekvensen. Variantene kan være homozygote (variant er til stede i alle reads) eller heterozygote (variant er ikke til stede i alle reads, gjerne 50% av de). Heterozygot variant tyder på mutasjon i ett allel.
Fra dette dannes en VCF fil (Variant Call Format), som er en stor fil med alle varianter og mye informasjon, som blant annet posisjon, variant, sekvenseringsdybde, genotype og kvalitet.
Hva er annotering? Gi eksempler på annoteringer.
Nå ønsker vi å finne ut så mye som mulig om de variantene vi har funnet. Annoteringer kan brukes til å skreddersy hvert enkelt prosjekt. Eksempler på annoteringer; gen, hvor i gen (intron, eksos, 5utr, 3utr), type endring på både DNA- og proteinnivå, type variant (frameshift, synonym/stille, missens, nonsens), allelfrekvens (hvor vanlig varianten er i befolkningen, kan være vanlig i befolkningen uten å være til stede i referansesekvdens)
Hvorfor er annotering nyttig?
Nyttig i vurdering av varianters patogenisitet, og for å filtrere ut kun det som er interessant i casen.
Hvordan filtreres varianter som er funnet?
All data i aktuelt panel sendes inn i nytt program. På St Olav benyttes «Ella».
Varianter som ikke er interessante, filtreres ut. Ved senere vurdering som interessante kan disse hentes inn igjen. De fleste varianter vil filtreres ut (eks i forelesning; 117 av 118 varianter filtrert vekk).
Hva gjøres med varianter som ikke filtreres vekk?
Eventuelle varianter som ikke filtreres vekk, må så vurderes. Dette gjøres ved hjelp av databaser og et klassifiseringssystem.
Eksempler på databaser er genomAD, flossie og interne databaser.
Når kan interne databaser være nyttige i vurdering av en variant?
De interne databasene kan vøre nyttige i forbindelse med Founder mutasjoner, mutasjoner som er hyppigere i noen befolkningsgrupper enn andre.
Hvilket klassifiseringssystem benyttes i Europa?
ACMG, system som standardiserer tolkningen. Går ut på å samle beviser som samlet gir varianten en score og plasserer den i 1 av 5 klasser. Bevisene vektes som sterke, moderate eller støttende.
Hva er spesielt med VUS-klassen?
VUS: variant av usikker klinisk betydning. Ikke nok beviser for å vurdere som patogen eller normal.
Deles inn i 5 klasser; ice cold, cool, tepid, warm og hot. Når klasse 3 er hot, kan den noen ganger gis ut.
