NGS i medisinsk mikrobiologi Flashcards
Hva er den største utfordringen med NGS i medisinsk mikrobiologi?
Uten om at NGS er en komplisert metodikk i seg slev, er det innen medisinsk biokjemi tilstedeværelse av humant DNA som er en av de største utfordringene, da det er bakteriens eller virusets DNA/RNA vi er ute etter.
Siden humant DNA er en utfordring, ønsker vi å kvitte oss med dette. Det kan til eksempel gjøres ved hjelp av bakteriedyrkning for de bakteriene som lar seg dyrke, eller ved hjelp av PCR.
Ved hjelp av NGS har man funnet «nye» bakterier, som er varianter av en bakterie som skiller seg så mye ut fra de andre at den ikke kan klassifiseres som de. I slike tilfeller er nye slekter og arter funnet opp. Et eksempel er Sytaphylococcus argenteus fra 2015, som tidligere gikk under s.aureus.
Er det samme etiske problematikk ved NGS i mikrobiologi, som i genetikk?
NGS i medisinsk mikrobiologi begrenses ikke av etiske utfordringer. Det kan være etisk «feil» å dele humant DNA, mens det er opprettet store databaser med bekterielt DNA som er svært nyttig innen bioinformatikken.
Hvorfor er helgenomsekvensering mer brukt i medisinsk mikrobiologi enn i genetikken?
Siden virusgenomet (29,9 kb) er så lite i forhold til det humane genomet, vil det ikke være like stor jobb å helgenomsekvensere. Det samme gjelder bakterier.
Siden man ofte ikke helt vet hva man ser etter, kan det være hensiktsmessig å helgenomsekvensere bakterier og virus.
Gi (2) eksempler på bruk av NGS i medisinsk mikrobiologi.
Eksempel bakterieinfeksjoner:
En pasient med hofteprotese opplever en stadig tilbakevendende infeksjon. For å kunne behandle pasienten best mulig, vil det være avgjørende å vite om den tilbakevendende infeksjonen skyldes samme bakterie, eller om det er en ny bakterie. Klarer ikke kroppen å kvitte seg med bakterien, lykkes ikke behandlingen, eller er det en ny bakterie?
Den beste metoden for å finne ut om det er den samme bakterien, er å sammenligne hele genomet til bakterien ved de ulike infeksjonene.
Dersom man opplever flere tilfeller av en sykdom i et område inne en gitt tidsperiode enn hva som er forventet, eller får to eller flere tilfeller av samme sykdom med en antatt felles kilde, kan det være nyttig å benytte sekvensering i smittesporingsarbeidet for å henholdsvis oppdage og/eller oppklare smitteutbrudd.
Bakteriene i utbruddet sekvenseres, og det settes opp et minimum spanning tree, som viser hvor like hverandre bakteriene i et utbrudd er.
Et annet hjelpemiddel som viser likheten av bakteriene, er en SNP-matrise, som kan vise grupper innad i et utbrudd som er mer like enn andre. For å benytte SNP-matrise må man kjenne til mikrobemutasjonshastigheten.
Hvordan benyttes delgenomsekvensering (sangersekvensering) i forbindelse med coronaviruset?
Spike-proteinet (3800bp) er sentralt (proteinet som kjennes igjen av våre humane celler). Det fungerer som en nøkkel til om viruset tas opp i kroppen eller ikke, og sier noe om hvor sykdomsfremkallende viruset er. Sekvenseringen har som mål å påvise mutasjoner i spikeproteinet.
Det benyttes ett primerpar, og dannes et PCR-produkt på 700-800bp. Dette er kortere enn sekvensen for hele spike-proteinet, men når vi vet hva vi leter etter kan vi sekvensere bare den viktigste delen av proteinet.
Hvordan gjøres helgenomsekvensering (NGS) i medisinsk mikrobiologi?
En helgenomsekvensering vil kunne påvise alle mutasjoner i det aktuelle viruset. Det benyttes over 100 primerpar, og hele genomet kartlegges.
En helgenomsekvensering innebærer mye manuelt arbeid, og er derfor svært tidkrevende. Det jobbes hele tiden med automatisering og forenkling i alle deler av prosessen, men per nå er mye av det manuelle arbeidet bedre enn det maskinelle.
- RNA ekstraksjon
- cDNA-syntese
- Multiplex PCR med >100 primerpar
- Bibliotekspreparering
- Sekvensering
- Analyse
Hva er mutasjonsanalyser, og hvorfor er ikke dette en god metode i medisinsk mikrobiologi?
Mutasjonsanalyser med PCR er raske, men det vil være krevende å benytte denne metoden for å avdekke mutasjoner da det hele tiden vil være behov for utvikling av nye analyser i takt med utvikling av nye virusvarianter. Man kan ikke stole på analysen siden det hele tiden er noe nytt.
Hvilken rolle har bioinformatikk i medisinsk mikrobiologi?
Ved hjelp av internasjonale databaser for resistensgensekvenser (bioinformatisk verktøy), kan man finne resistensgener i bakteriegenomer man har sekvensert. Dette gjøres enkelt ved å laste opp bakteriegenomet i en database (eks ResFinder hos Center for Genomic Epidemiology), og bioinformatiske verktøy på siden vil sammenligne bakteriegenomet mot databasen og vise eventuelle resistensgener.
Man er helt avhengige av bioinformatiske verktøy for å kunne nyttegjøre all data man får gjennom nestegenerasjonssekvensering/helgenomsekvensering.
Hva er indexering? Hvorfor er dette nyttig?
En form for primer som binder til PCR-produktene. Ulik primersammensetning i hver prøve gir en unik «merkelapp» på hver prøve som gjør det mulig å skille flere ulike prøver fra hverandre etter sekvensering (vha datasystem). Nyttig siden analysen er kostbar og man vil kjøre så mange prøver som mulig på en gang.
