Metaganomikk i medisinsk mikrobiologi Flashcards
Hvorfor er 16S ribosomal RNA viktig/mye brukt i mikrobiologisk diagnostikk? Hva er 16S?
Hva er begrensningene?
16S utgjør en del av 30S-subenheten på ribosomet, som er den lille subenheten. Genet er konservert, men har variable områder som vil være ulike hos ulike typer bakterier. Ved hjelp ab 16S kan vi skille mellom bakterier ned til art, og eventuelt også slekt (genus).
Fordelen med 16S er at analysen er kulturuavhengig, altså man er ikke avhengig av at bakterien vokser på agarskål for å gjennomføre analysen. Det er også en relativt billig analyse som ikke genererer så mye data (enklere å håndtere.
Gir kun informasjon om bakterier, ikke virus og sopp! Også viktig å huske at det alltid vil være større sikkerhet i å bruke hele genomet, enn bare ett gen (eks 16S).
Hva er et mikrobiom?
Samlingen av alle mikroorganismer som lever på indre/ytre overflater hos mennesker/dyr/planter/sopp. Omfatter både nyttige, harmløse (hverken til gagn eller nytte) og unyttige mikroorganismer. Kan også betegne alle mikroorganismer som danner samfunn på overflater/i jord.
Hva er et metagenom?
Genomene fra alle individuelle organismer til stede i en miljøprøve eller klinisk prøve. Motsetning til genom, som er genomet til én bestemt organisme.
Hva er metagenomikk?
Uthenting av genetisk informasjon ved hjelp av genomsekvensering fra metagenomisk prøvemateriale uten isolering eller kultivering (dyrking).
I diagnostikken innebærer dette deteksjon og identifikasjon av alle patogene mikrober i et klinisk materiale. Dette gjøres direkte, på St. Olav ved hjelp av shotgun-sekvensering.
Hva er OTU?
Operational Taxonomic Unit.
Grupper av nært beslektede (nesten identiske) individer. Refererer ofte til clustere av ukultiverbare mikroorganismer gruppert basert på likhet i DNA.
Hva er begrensninger ved sangersekvensering i metagenomikk?
Sangersekvensering har en begrensing på ett fragment (750bp) av gangen. Hvis man sammenligner dette med det humane genomet på 3,210^9 bp vil det ta svært lang tid å sekvensere med sanger. Andre eksempler er E.coli på 510^6 bp, og til og med SARS-CoV-2 på 30 000bp vil være svært tidkrevende med sanger.
Sangersekvensering vil altså bli alt for tid- og arbeidskrevende i diagnostisk metagenomikk.
Sangersekvensering av 16S baserer seg dessuten også kun på ett gen, og det er derfor begrenset informasjon. Ikke sikkert man kommer seg ned på artsnivå.
Hva er shotgunsekvensering? Fordeler/ulemper?
Sekvensering av tilfeldige DNA-fragmenter.
DNA deles opp i mange tilfeldige, små segmenter, som så sekvenseres (= reads). Ved hjelp av bioinformatikk vil disse små segmentene kunne settes sammen til en kontinuerlig sekvens siden flere av de små segmentene vil overlappe hverandre.
Fordelen med shotgunsekvensering er at man ikke bestemmer på forhånd hva man ser etter, men det vil vise det som er der. Shotgunsekvensering har også høyere kapasitet, og ikke samme behov for utvikling eller kunnskap om det man ser etter, annet enn at det må ha DNA/RNA.
Ulempen er at det er kostbart, man vet ikke om det man finner er fra noe som lever og har potensiale til å gi sykdom, eller om det er fra noe dødt. Det er mye arbeid som skal til før det kan benyttes klinisk da alle funn må valideres. Siden det er mange mikroorganismer vi ikke kjenner genomet til, vil også mye gå «under radaren». En annen problematikk er personvern, og ikke minst hvor mye plass de enorme datamengdene tar – infrastruktur.
Viktige forskjeller 16S (sanger) og NGS (shotgun)
16S: rask (min-t), billig, baseres på ett gen, slekt/genus identifikasjon. Kun bakterier, ikke virus og sopp.
NGS: langsom (t-dgr), kostbart, helmetagenom, species/stain identifikasjon. Geners tilstedeværelse/fravær, varantanalyse. Kan også identifisere virus og sopp.
