Mikroskopie Flashcards
19. Vorlesung
Welche Methoden zur Mikroskopie fixierter Zellen gibt es?
Transmissions Elektronen-Mikroskopie, Raster-Elektronen-Mikroskopie und 3D-Rekonstruktion von EM-Aufnahmen.
Wie funktioniert die Transmissions Elektronen-Mikoskopie?
- starke Fixierung
- Dehydrierung: Einbettung in Harz
- Ultra/Mikrotom für Ultra/Dünnschicht
Welche Probleme treten bei der Transmissions Elektronen-Mikroskopie auf und welche Lösungen gibt es?
- C/N/O/H sind nicht sehr elektronendicht
- > Färben mit Salzen schwerer Metalle und Immunogold Methode - Ist das Objekt nach den Behandlungen noch realistisch?
- > Cyro-EM (ultraschnelles Einfrieren)
Was macht man mit der 3D-Metallbeschattungs-TEM?
Oberflächen sichtbar.
Wie funktioniert die 3D-Metallbeschattungs-TEM?
- Objekt auf Platte fixieren und mit Schwermetallen bedampfen
- mit Carbon überzogen und org. Objekt weggespült
- Mikroskopieren
Was versteht man unter der Raster-Elektronen-Mikroskopie (REM)?
- sichtbar-machen von Oberflächen
- Elektronen werden auf Objekt geschossen und abgelenkte oder emittierte Elektronen detektiert
- Objekte werden i.d.R. fixiert, getrocknet u. mit Schwermetallen beschattet o. eingefroren
Welche Methoden gibt es bei der 3D-Rekonstruktion von EM-Aufnahmen?
Rekonstruktion aus Schnitten, Block-face EM und EM Tomographie.
Was macht man bei der Rekonstruktion aus Schnitten?
Es werden in jedem Schnitt Umrisse definiert, die Exakt übereinander gelegt werden und vom Computer rekonstruiert werden.
Wie funktioniert die Block-face EM?
Schnitte werden mit einem Microtom im EM gemacht, Aufnahmen der zurückgestrahlten Elektronen der perfekt übereinander liegenden Schnitte werden genommen und der Computer rekonstruiert die 3D-Struktur.
Wie funktioniert die EM Tomographie?
Man nimmt das Objekt aus verschiedenen Winkeln auf und der Computer berechnet das 3D-Modell.
Welche Methoden für die Mikroskopie lebender Zellen gibt es?
(Konfokale) Fluoreszenz-Mikroskopie, Digital Scanned Laser Sheet Fluorescent Microscopy, Stimulated Emission Depletion-Mikroskopie und Reporter-Systeme für in vivo imaging.
Wie funktioniert die Fluoreszenz-Mikroskopie?
Ausgehend von einer Lichtquelle wird Licht einer best. Wellenlänge auf einen chromatischen Spiegel gelenkt, der mit Licht best. Wellenlänge reflektiert.
Wir funktioniert konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie?
Nur Licht aus dem Fokuspunkt gelangen in den Detektor und ein Punkt nach dem anderen wird beleuchtet, wobei optische Schnitte in mehreren Ebenen erstellt werden.
Wie funktioniert die Digital Scanned Laser Sheet Fluorescent Microscopy?
Anregung erfolgt über die Seite eines Lichtschildes mit dem zu untersuchenden Objekt, wodurch die Beleuchtung nur in einer Fläche stattfindet. Die Aufnahme des Objekts ist rechtwinkelig dazu und das Objekt wird gedreht.
Wie funktioniert die Stimulated Emission Depletion-Mikroskopie?
Aufbau wie konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. Fluoreszente Moleküle können durch Beleuchtung “ausgeschaltet” werden. Geht entgegen der Auflösungsgrenze.
