Expressionsmuster bestimmen Flashcards
15. Vorlesung
Wie erfolgt die whole mount in situ hybridization?
- markierte Antisense-Probe herstellen
- Hybridisierung: Sonden binden an die mRNA in der Zelle
- Antikörper mit fluoreszentem Farbstoff oder gekoppeltes Enzym zugeben
- die Lokalisation oder Aktivität der mRNA wird durch die Signaldetektierung bzw. die Farbreaktion sichtbar
Was versteht man unter Immunhistochemie?
- ein spezifischer Antikörper (primärer Antikörper) wird hergestellt und zum Embryo gegeben
- ein sekundärer Antikörper, der mit Enzymen gekoppelt ist oder ein fluoreszierendes Protein trägt, wird hinzugegeben
- die Lokalisation des Antigens wird durch die Detektion der Fluoreszens bzw. der Farbreaktion sichtbar
Was ist der Vorteil enzymatischer bzw. fluoreszenter Detektion?
Enzymatisch: deutliches Signal
Fluoreszent: genaueres Signal
Was machen Reporter-Gene?
Zeigen Expression an, interferieren aber möglichst wenig mit der Funktion anderer Gene/Proteine.
Was versteht man unter Insertionsmutagenese?
Die Kreuzung eines Stammes mit einer Transposase und eines Stammes mit Markergenen. Das kann zum Springen des Markergens führen und eine Mutation hervorrufen.
Wodurch kann man die Expressionhöhe bestimmen?
DNA-Arrays, quantitative real time PCR, RNA-Sequencing und single cell sequencing.
Wie funktioniert die DNA-Arrays-Methode?
- Sammlung von Gen-spezifischen DNA-Molekülen
- PCR-Amplifizierung
- ‘printing’ auf eine Glasscheibe
- waschen und die Signalfarben scannen
- relative Expressionshöhe wird ermittelt
Wie funktioniert die quantitative real time PCR?
- zuerst RNA-Isolierung/Zerstörung der DNA
- Zugabe von genspezifischen Primern
- reverse Transkriptase
- Zugabe von Farbstoff, der nur fluoresziert, wenn DNA bindet
- reguläre PCR
- Messung der Farbstoffintensität
Was versteht man unter single cell sequencing?
Die Zellen werden in Vesikeln seperiert und mit einem bestim. Barcode versehen. Der Poly-T-Schwanz der Beads bindet an den Poly-A-Schwanz der Gene in den Zellen.
