Métodos imunológicos Flashcards
O que é o Ensaio Imunoenzimático de Adsorção (ELISA)?
É um teste sorológico imunoenzimático que se
baseia na ligação do antígeno + anticorpo,
detectável através de reações enzimáticas
Como o ELISA funciona ?
a enzima é ligada ao antígeno ou anticorpo, que reconhece o alvo que está sendo pesquisado. A presença de antígenos e/ou anticorpos na amostra é revelada pela mudança de cor depois da adição do substrato dessa enzima e de uma substância cromógena, indicando uma reação positiva.
Existem vários tipos de ELISA:
Enzimas mais utilizadas no ELISA:
Peroxidase e fosfatase alcalina
Como é possivel medir o resultado no ELISA?
Quanto mais cor, mais positivo é o paciente. Essa medição é feita com leitor de densidade ótica (DO), indo de 0,01 (incolor) até 3,0.
Quanto mais anti-corpo for mobilizado à amostra, mais enzima vai estar presente, mais enzima vai reagir localmente e produzir essa cor característica, aumentando a densidade óptica.
O que é o ELISA direto?
- Busca a doença de forma direta, ou seja, procura
o antígeno - Portanto, quem está ligado à placa é o antígeno e
o que será adicionado como reagente é o anticorpo
conjugado a um emissor de cor
Como é feito o ELISA indireto?
- Um antígeno é conectado à placa (adsorção)
- É feita uma lavagem para retirar os antígenos que
não se ligaram - Adicionar o reagente (soro do paciente). Nessa
etapa, se o soro do paciente tiver anticorpos, ocorre
a ligação do antígeno com o anticorpo - Fazer a lavagem: anticorpos não ligados ao
antígeno são retirados - Adicionar um anticorpo ligado à enzima
(conjugado), portanto forma-se um complexo de:
antígeno + anticorpo do paciente + anticorpo ligado
à enzima - Adicionar o substrato cromogênico específico da
enzima. Caso ocorra a ligação desse substrato com
a enzima = reação muda de cor, configurando um
resultado positivo
O ELISA pode dar falso positivo?
SIM!
exames com muita sensibilidade estão
sujeitos a falsos positivos (o anticorpo se ligar num
antígeno que não deveria), por isso utilizamos o Cut-off, que aumenta a especificidade do teste.
O que é o Cut-Off?
Ponto de corte, é o mínimo de densidade óptica que deve ser constatada na amostra para que o teste seja considerado positivo.
Evita falsos positivos, pois eventualmente algum anticorpo se liga no antígeno exposto de maneira inadequada, gerando certo grau de densidade óptica.
Obs: geralmente o Cut-off é 1,0
* No caso de Cut-off para HIV, temos que:
◦ < 0.9 = não reagente
◦ 0.9 ~ 1.1 = indeterminado. Nesses casos, deve-se
realizar outro ELISA 14 dias depois, pois o
paciente pode estar na janela imunológica
◦ > 1.2 = reagente
O que é o ELISA em sanduiche?
ELISAmuito utilizado para dosar hormônios: beta-HCG, PSA, T3, LH, testosterona, TNF-alfa,
IL-6, vitaminas, estradiol, FSH e GH.
- Um anticorpo monoclonal é adicionado à placa
e se liga à sua superfície (adsorção)
Obs: esse anticorpo fica com a porção Fab para
cima - É feita uma lavagem para retirar os anticorpos
livres - A amostra é adicionada. Se os antígenos
estiverem presentes há ligação com os anticorpos - Uma nova lavagem é feita para retirar os
antígenos não capturados - Um anticorpo + enzima (conjugado) é
adicionado - Mais uma lavagem é feita para retirar os
conjugados que ficaram livres - O cromógeno e no substrato são adicionados, e
se o cromógeno for oxidado pela enzima, haverá
formação de cor
Qual é a diferença do ELISA pra quimioluminescência?
Ao invés de ter uma enzima que libera cor, há emissão
de partículas quimioluminescentes, que serão
contadas por um leitor.
É mais
automatizado, boa metodologia e de fácil leitura.
Atualmente, maioria dos testes de sorologia são
feitos por essa técnica
Como é feita a imunofluorescência direta?
- Utiliza-se um tecido não fixado, como biópsia,
aspirado ou secreção, que contém o antígeno - Os anticorpos são conjugados a um fluorocromo
(marcador fluorescente) que, quando excitado por
radiações ultravioletas, emitem luz no espectro
visível, permitindo a sua identificação por
microscopia - Etapas:
1. Material fixado na lâmina
2. Anticorpo marcado com fluoresceína é incubado
3. Leitura em microscópio de fluorescência
pra que serve a imunofluorescência indireta?
Utilizada para detectar a presença de um
anticorpo específico no soro
Como é feita a imunofluorescência indireta?
- O antígeno é fixado na lâmina
- Adicionar o soro do paciente: se formar um
complexo, há anticorpos para o antígeno - Adição de imunoglobulina sérica anti-humana
marcada com fluoresceína
Obs: imunoglobulina sérica anti-humana = reage
com qualquer anticorpo humano - Incubação e lavagem da lâmina
- Examinar em microscópio de fluorescência: se o
antígeno fixado à lâmina fluorescer = antígeno
presente
Teste de
imunofluorescência indireta utilizado quando
suspeita-se de doença autoimune:
FAN (fator anti-nuclear)
