Metoder

Question 1

Redegør kort for hvorfor det er vigtigt at måle de frie cirkulerende niveauer af thyreoideahormoner fremfor den totale mængde, og beskriv kort en målemetode hvormed man kan bestemme den frie mængde af Thyreoidea hormon

Beskriv RIA (radioimmuno assay)

Answer 1

• Det er kun den frie mængde i blodet som er biologisk aktivt.
• Frit thyreoidea hormon kan bestemmes med RIA: Frit T4 eller T3 kan bestemmes ved Radioimmuno assay (figur R&B fig 30.7 og 30.8 og B&B 46-1).

Radioimmuno assay

• Kræver et specifikt antistof mod target hormon f.eks. T4, radioaktivt mærket hormon (T4), standarder indeholdene kendte mængder af ”koldt” hormon(T4).
• Til samtlige prøver(standarder og de ukendte patientprøver) tilsættes samme mængde antistof og radioaktivt mærkede hormon(T4).
• I prøverne og standarderne vil nu være en kompetitiv konkurrence om binding til det hormonspecifikke antistof.
• I prøver med højt indhold af hormonet (T4) vil mængden af radioaktivt mærket hormon bundet til antistoffet være lavt og visa versa.
• Prøverne vaskes så kun antistofbundet hormon er tilbage. I disse prøver måles radioaktiviteten og ud fra standarderne med kendt mængde hormon(T4) laves en standardkurve.
• Dermed kan radioaktiviteten i de ukendte prøver aflæses på standardkurven og mængden af hormon bestemmes eller ved ELISA:
  
  • I bunden af en ELISA-brønd fæstnes et antistof rettet mod frit T4 til pladen tilsættes en standard række med kendte mænder af T4 og plasmaprøver med ukendt mængde af frit T4. T4 vil nu binde sig til antistoffet på bunden af brønden.
  • Pladen skylles så ubunde proteiner fjernes.
  • Dernæst tilsættes et andet antistof som genkender T4. Dette antidtof har påkoblet et enzym (f.eks. Horseradish peroxidase).
  • Overskydne antistof vaskes væk og der tilsættes et substrat som det sidste antistof reagerer med under farvedannelse f. eks. - ortho-phenylenediamine dihydrochloride= gul farve).
  • Mængden af gul farv bestemmes spektrofotometrisk. Ud fra standardrækken kan mængden af frit T4 i plasmaprøverne bestemmes.

Question 2

Beskriv Radioimmuno assay

(Der bl.a. kan bruges til bestemmelse af cirkulerende niveau af TSH eller T4, for at afgøre, om der er tale hyper- eller hypothyreose)

Answer 2

• Kræver et specifikt antistof mod target hormon f.eks. T4, radioaktivt mærket hormon (T4), standarder indeholdene kendte mængder af ”koldt” hormon(T4).
• Til samtlige prøver(standarder og de ukendte patientprøver) tilsættes samme mængde antistof og radioaktivt mærkede hormon(T4).
• I prøverne og standarderne vil nu være en kompetitiv konkurrence om binding til det hormonspecifikke antistof.
• I prøver med højt indhold af hormonet (T4) vil mængden af radioaktivt mærket hormon bundet til antistoffet være lavt og visa versa.
• Prøverne vaskes så kun antistofbundet hormon er tilbage.
• I disse prøver måles radioaktiviteten og ud fra standarderne med kendt mængde hormon(T4) laves en standardkurve.
• Dermed kan radioaktiviteten i de ukendte prøver aflæses på standardkurven og mængden af hormon bestemmes
• figur R&B fig 30.7 og 30.8 og B&B 46-1

Question 3

Beskriv ELISA

Answer 3

• I bunden af en ELISA-brønd fæstnes et antistof rettet mod frit T4, og til pladen tilsættes en standard række med kendte mænder af T4 og plasmaprøver med ukendt mængde af frit T4.
• T4 vil nu binde sig til antistoffet på bunden af brønden.
• Pladen skylles så ubunde proteiner fjernes.
• Dernæst tilsættes et andet antistof som genkender T4.
• Dette antistof har påkoblet et enzym (f.eks. Horseradish peroxidase).
• Overskydene antistof vaskes væk og der tilsættes et substrat som det sidste antistof reagerer med under farvedannelse f. eks. - ortho-phenylenediamine dihydrochloride= gul farve).
• Mængden af gul farv bestemmes spektrofotometrisk.
• Ud fra standardrækken kan mængden af frit T4 i plasmaprøverne bestemmes.