Methods of sequencing Flashcards
Restrikční endonukleázy
Enzymy bakteriálního původu, které jsou schopny štepit DNA na specifických místech. Mají bakteriální původ, slouží bakteriím jako obrana proti vnější DNA.
Pallindromová sekvence
Sekvence DNA, která se čte stejně odpredu i odzadu.
Lepivé a tupé konce
Lepivé konce- mají na svém konci přesahy
Tupé konce- štepí řetezce přímo proti sobě
Restrikční mapa
Typ fyzické mapy, kdy se DNA nechá štepit různým typem restrikčních endonukleáz a následně se tyto fragmenty izolují elektroforézou.
Hybridizace nukleových kyselín
Proces, kdy se DNA sonda naváže na daný gen. Prvním krokem je denaturace DNA vysokou teplotou a nebo kyselým pH. Poté se sonda naváže na DNA v souladu s principem komplementarity, přičemž má obvykle navázanou fluorescenční barvičku /renaturace/. Patrí mezi rutinní cytologické vyšetření.
Southernův přenos
Přenos hybridizované DNA na nylonovou destičku, která umožnuje fixaci DNA.
FISH
Fluorescenční in situ hybridizace je cytologická metoda, která detekuje geny přímo v bunce.
DNA čipy
Miniaturizované zařízení, které se skládá z DNA sond pro dané geny. Většinou se využívá cDNA.
Příklad: nádorová bunka je vysoce proteosynteticky aktivní a tím pádem produkuje i mnoho proteinů, které nemusejí být exprimovány od derivované bunky. cDNA transkriptomu nádorové bunky se vloží na čip, dojde k hybridizaci a navázání sondy. Sonda začně emitovat světlo. Pro komparaci se využívá i hybridizace derivované bunky s jiným typem sondy /září jinou barvou/.
Klonování DNA
Dva významy: vytvoření mnoha molekul DNA nebo je to proces izolace úseku DNA z genomu, který je usnadněn specifickou amplifikací genu.
Rekombinantní molekula DNA
Molekula, která je složena z původní DNA a exogenní DNA. Obě molekuly jsou štepeny stejnými restrikčními endonukleázami a spojeny pomocí DNA ligázy.
Plazmidový klonovací vektor
Plazmidy mohou být štepeny restrikčními endonukleázami a dále pomocí ligázy spojeny s exogenní nukleovou kyselinou. Tak vzniká rekombinantní DNA. Bakterie poté můžeme kultivovat a poté se plazmid mnohonásobně replikuje a poskytuje velké množství kopií genu.
Izolace genu
Genetická informace je štepena na malé fragmenty pomocí endonukleáz. Poté se fragmenty elektroporací nebo teplotným šokem dostanou do bakterie, kde se inkorporují do plazmidu. Tyto bakterie se namnoží a vzniknou kolonie, které mají stejný plazmid. Dále se vyhledá v genomové knihovně sekvence genu /zjištuje se z proteinu/ a syntetizuje se podle ní další sonda. Kolonie se mezitím přenesou na nylonovou desku a přidá se sonda s fluorescenční značkou. Záření poté ukáže na hledaný gen, kolonie jsou izolovány a dále kultivovány.
cDNA knihovna
Obsahují klony se sekvencemi, které vznikly zpětným přepisem mRNA do DNA.
Příprava DNA knihovny: izolace mRNA, přepis mRNA do DNA pomocí polyA primerů a reverzní transkriptázy. cDNA neobsahuje žádné introny. Následuje vložení DNA do plazmidu a dále kultivace bakterií.
PCR /Polymerázová řetezová reakce/
Metoda zahrnující denturaci, navázání primerů, poté DNA polymerázy /Taq polymeráza, strádá provereadingovou aktivitu/, Takto je syntetizována další molekula DNA a proces pokračuje exponenciálně. Obvykle 20-30 cyklů.
Real time PCR
Založena na sledování průběhu polymerázové řetezové reakce přímo během reakce. Přístoje toto umožnující se nazývají cyclery. Může být specifická a nespecifická. Plataeu fáze je fáze, kdy nedochází k výrazné změne intenzity záření /nedostatek primerů nebo nukleosidtrifosfátů/. Využívá se např. při detekci genomu nebo v kriminalistice.
