méthodes d'études de la cellule Flashcards
Définitions
c’est quoi l’épaisseur ?
=épaisseur de la préparation donc épaisseur de l’échantillon observé
Définitions
comment doit être l’épaisseur en MO ?
échantillons très fins qui permet d’obtenir transparence à l’inverse des loupes binoculaires
Définitions
c’est quoi le grossissement utile ?
- = rapport théorique qu’il y a entre les dimensions d’un objet vu à l’oeil nue et à travers l’instrument
- il permet à l’oeil de distinguer tous les détails les plus fins distinguement
Définitions
comment on va obtenir le grossissement de l’appareil optique ?
en multipliant les grossissements de chaques élements de l’appareil : oculaire, objectif…
Définitions
l’observation c’est quoi ?
- via le microscope se fait uniquement par transparence
- via la loupe binoculaire via une lumière réfléchie pour obt opaques
Définitions
la profondeur de chps c’est quoi ?
=zone comprise enter le premier et le dernier plan net de l’image
que ce passe-t-il pour la profondeur de champs si l’échantillon est proche ?
la profondeur de chp est faible
que ce passe-til pour la profondeur de chp si on a un fort grossissement ?
profondeur de champ est faible
Ct évolue ka profondeur de champ en fonction du grossissement ?
plus le grossissement ↗︎, plus la profondeur de champ ↘︎
Définitions
c’est quoi la résolution ?
= dist la plus petite entre 2 points d’un échantillon pour qu’ils puissent ête distinguer
quelle est le pouvoir de résolution pour oeil humain ?
75μm
pr obt observé à ≈25cm
quelle est le pouvoir de résolution pour une loupe binoculaire ?
≈ 2μm
formule résolution ?
R= 0,61 (𝝀/n.sin 𝛼)
c’est quoi la limite de résolution ?
dist la + petite entre 2 obt pour qu’ils puissent être distingués ds meilleures conditions d’observations possibles
comment évolue la résolution en fonction de la longueur d’onde 𝝀 et de la dist ?
+ la longueur d’onde ↘︎ + la limite de résolution=dist minimale ↘︎ et donc réolution ↗︎
comment est la résolution d’un ME comparé à un MO ?
résolution meilleure en ME qu’en MO car longueur d’e- plus courte que celle d’un photon
comment est la résolution quand elle est meilleure qualitativement ?
elle est faible quantativement = image plus nette quand la résolution est une faible dist
comment la longueur d’onde et la résolution varie ?
en terme de qualit” ils varient en sens inverse
comment varit la longueur d’onde et la limite de résolution ?
en terme de qualité
en terme de qualité ils varient dans le même sens
dnas le microscope quels élements permettent de controler le diamète de la zone éclairée de la préparation ?
le consenseur et le diaphragme
que permettent le condenseur et le diaphragme ?
permettent de controler le diamète de la zone éclairée de la préparation en condensant ± la lumière
comment on peut condenser la lumière ?
en refermeant le diaphragme : plus on le referme plus on condense la lumière
quels sont les ≠ types de microscope à lumière =MP ?
MP = microscope photonique
- microscope par transmission
- microscope à lumière polarisée, microscope à fond noir et microscope à contraste de phase
- microscope confocal à balayage
pourquoi on utilise les microscopes par transmission ?
pour observation directe de structure
pouvoir de résolution du microscope par transmission ?
0,2 μm
que permettent les. microscope à lumière polarisée, microscope à fond noir et microscope à contraste de phase?
informations indirectes sur ultrastructure des cell
que va utiliser le microscope confocal à balayage comme source lumineuse ?
un laser et permet d’obtenir image en 3D
que vont utiliser les MP comme type de lumière?
lumière visible : 390 à 760 nm
comment se fait l’observation de la loupe binoculaire ?
- en lumière réfléchie=>obt opaque
- trnasparence
limite de résolution de la loupe binoculaire ?
≈ 2μm
grossissement utile de la loupe binoculaire ?
x200 ≈
commet se fait l’observation au MP classique = droit ?
uniquement pas transparence sur échantillons de faibles épaisseur : <10μm
limite de résolution du MP ?
0,2 μm
grossissement utile du MP ?
x40 à x1250
chemin de la diffustion de l’image ?
- lampe
- préparation
- objectif
- oculaire
- oeil
l’objectif et l’oculaire ont-ils chacun un grossissement propre ?
oui chacune à un grossissement propre
que va percevoir l’oeil en MP ?
il percoit image grossie par l’oculaire et l’objectif
formule du grossissement totale ?
Gtot = Gonjectif * Goculaire =G1*G2
entre quel nombre est compris le Gtot ?
entre 40 et 1250 (oculaires souvent G = 10 et objectif G fixe ente A et 100)
que donne l’objectif comme image ?
une image agrandie et renversée
que fait la lentille quand on a un objectif à immersion ?
lentille baigne dnas un liquide dont l’indice de réfraction est proche de cleui de verre =améliore résolution
que fait l’oculaire à l’image ?
il l’agrandit une seconde fois
que voit donc l’oeil au MP classique ?
une image virtuelle agrandie renversée
MP inversé c’est quoi le ppe ?
le même que pour le microscope droit sauf que lumière incident éclaire obt d’en haut et objectif est en dessous
MP inversé
le MP inversé permet d’observer quoi ?
les cell en cultures à travers le fond d’une boite transparente
MP inversé
comment se fiat observation enMP inversé?
par transparence
MP inversé
limite de résolution MP inversé?
≈0,2 μm
MP inversé
grossissement utile du MP inversé?
x40 à x1250
comment se fait l’éclairage en microscope confocal ?
par balayeg laser
microscope confocal
quand on utilise microscope confocal?
en fluorescence
microscope confocal
peut on avoir une iamge 3D avec le microscope confocal?
oui si on fait un traitement informatique
microscope confocal
quel est le but de faire un traitement informatique ?
réduire le bruit de fond= lumière émise par fluorochromes situés hors champ => **résolution améliorée **
comment est le materiel biologique ?
relativement transparent, réfringent et peu visible à l’état frais
que veut dire le terme réfringent ?
il dévie bcp la lumière
que va-t-on vouloir faire pour améliorer l’observation du matériel biologique ?
on peut l’améliorer par l’optique et/ou par coloration
que premet la microscopie en contraste de phase ?
d’observer lesc ell san spréparation particulière ni coloration
ct fonciton la microscopie en contraste de phase ?
ds obt observé structures biologiques ont indice de réfraction ≠ de celui du milieu dans elquel elles se trouvent => ≠ niveaux de gris pour chaque milieu
microscopie en contraste de phase
comment est le matériel étudié ave la lumière ?
il est réfringent
microscopie en contraste de phase
que permet le contraste de phase ?
de selectionner lumière dévier par obt grâce ) 2 anneaux appariés
microscopie en contraste de phase
Où sont les 2 anneaux appariés ?
- l’un dans le condenseur = anneau clair
- ds objectif = anneau sombre
- l’ensemble laisse passer que la lumière réfractée
pourquoi on va utiliser le contraste de phase ?
pour étudier cell vivantes dnas contexte de culture cellulaire
inconvénient du contraste de phase ?
- résolution moins bonne
- apparition de halo
c’est quoi le contraste interférentiel ?
crée interférence lumineuse en lumière polarisé
comment fonction la lumière dans le contraste interférentiel ?
lumière direct est réduit par phénomènes interférentiel et la lumière qui traverse obt est transmise => pas de colorant
comment va être le faisceaux lumineux avec le contraste interférentiel ?
il est dédoublé avant traversée de l’obt puis recomposée => création interférence
comment sont les images quand on utilise le contraste interférentiel ?
excellente qualité mais fausse impressoin de relief …
pourquoi on utilise la technique du fond noir ?
- pour étudier cell transparents
- srtt utilisé en bactériologie =>apparaissent comme des pts brillants sur fond noir
La lumière source atteint-elle l’objet pour la technique du fond noir?
la lumière source n’atteint pas directement l’obt
Pq La lumière source n’atteint pas l’objet pour la technique du fond noir ?
car le condenseur est opaque et son centre bloque lumière
fond noir
comment sont les rayons lumineux squi sortent en péripherie de l’échantillon ?
trajet incliné et n’arrivent pas sur la lentille de l’objectif
fond noir
quelle est la seule lumière qui peut être observée ?
la lumière déviée et diffusée par objt => contraste très fort
que permet le fond noir ?
d’améliorer le contraste des échantillons
quels sont les avantages du fond noir?
pas de coloration à faire lors de la préparation
quels sont els inconvénients du fond noir ?
- intensité lumineuse très faible
- perte de structure de l’élément
En quoi consisite le phénomène de polarisation ?
à orienter le plan de vibration de la lumière
comment on va faire pour avoir le phénomène de polarisation?
on place échantillon entre un analyseur et un polariseur => detection variation de polarisation de la lumière => qd elle traverse échantillon
que permet de visualiser la polarisation?
les structures microscopiques qui polarise lumière =>structure biréfringente ou polarisante
qaund se fait la détection des variation de polarisation de la lumière ?
àpres la traversée de l’obt
polarisation
comment est orientée la lumière ?
en un seul plan donc on place 2 lames polarisantes
Où sont placées les 2 lames polarisantes ?
- polariseur entre source de lumière et condenseur
- analyseur après l’obt
polarisation
comment il faut que le polariseur et l’analyseur soit pour que lumière passe ?
parrallèle => transmission tot
polarisation
que ce passe-t-il qd la lumière ne passe pas ?
l’analyseur et le polariseur st perpendicuailres =>extinction tot
ds quelle domaine est utilisée la polarisation?
en minéralogie
l’épi fluorescence concerne qui ?
obt auto-fluorescent et les fluorochromes
c’est quoi la fluorescence ?
propriétés qu’ont ctne molé d’émettre photons d’E plus faible que photons de lumière incidente du microscope
l’épi fluorescence
vers quels longueurs d’onde la lumière excitatrice est ?
proche des UV
l’épi fluorescence
comment va être sélectionné lumière excitatrice ?
par filtres colorés après miroir semi transparent le dirige sur obt à travers objectif qui recueille lumière fluorescence émise par obt puis travers miroir semi transparent et autres filtres colorés adapté à sa longueur d’onde pour former image visible dans oculaire
c’est quoi un obt auto-fluorescent ?
il emmet fluorescence par eux même ex chlorophylle
comment on peut faire l’épi fluorescence si on a pas d’obt auto-fluorescent ?
on le combien avc luorochrome = fluorescence secondaire
ex de fluorochrome ?
le DAPI qui va s’incorporer dans ADN et émet fluorescence bleue qui eprmet visualiser ADN
quels sont les étapes pour préparer les lames de cell ?
- étalement
- fixation
- coloration
quelles sont les étape pour préparer lames de tissus biologiques ?
- fixation
- inclution
- coupe
- coloration
technique de réalisation coupes en paraffine
c’est quoi le but de la fixation ?
préserver les structure en l’état = lau plus proche du vivant + durcir les pièces
technique de réalisation coupes en paraffine
comment se fait la fixation ?
par immercion ds liq fixateur : plus élement petit plus fixation rapides
technique de réalisation coupes en paraffine
comment sera la qualtité de la fixation si elle est rapide ?
la qualité sera bonne
technique de réalisation coupes en paraffine
que va provoquer la fixation ?
la mort cellulaire donc elle arrête les réaction biologiques et fige le materiel
technique de réalisation coupes en paraffine
quels sont les 2 types de fixateurs ?
- fixateurs coagulants
- fixateurs additif
technique de réalisation coupes en paraffine
c’est quoi les fixateurs coagulant ?
=solvants organiques dont action pale est coagulation prot
technique de réalisation coupes en paraffine
ex de fixaterus coagulant ?
- alcool : méthanol, alcool
- acide : acide acétique ->très bien pour prot nucléaire moins pour prot cytoplasmique
technique de réalisation coupes en paraffine
c’est quoi les fixateurs additifs ?
provoquent pontages chimiques netre les prot =>liaisons covalents
technique de réalisation coupes en paraffine
ex de fixateurs additifs ?
- acide picrique
- aldéhydes : formol, glutaraldéhydes
- tétroxydes d’osmium ->bon fixateur pour lipides
quels sont les 3 préparation qu’on utilises pour fixation ?
- le formol tamponné
- liq de Bouin
- le Carnoy
technique de réalisation coupes en paraffine
comment on utilise le formol tamponnée dans la fixation ?
immersion ds formol puis rincage acev un tampon pour retire l’excès de fixateur
technique de réalisation coupes en paraffine
comment est le liq de Bouin ?
jaune, consituté d’acide picrique, de formol et d’acide acétique
technique de réalisation coupes en paraffine
le carnoy est consitué de quoi ?
d’acide acétique et de méthanol
technique de réalisation coupes en paraffine
que permet l’inclusion ?
de réaliser un bloc que l’on peut couper en traches fines et régullières
technique de réalisation coupes en paraffine
quel composant est le plus utilisé en inclusion ?
la paraffine car al consistance est bien homogène
technique de réalisation coupes en paraffine
étapes pour réaliser inclusion en paraffine ?
On plonge tissus ds :
1. l’eau pr le laver
2. bains d’alcools de C° croissante =>pr ne pas abimer tissu + déshydrater échantillon =>para très hydrophobe
3. solvant organique type toluène ou xylème pour clarifier= enlever alcool
4. paraffine liq chauffée à 56°C quise substitué au solvant
technique de réalisation coupes en paraffine
après étapes de fixation que fait-on de notr échantillon avec paraffine ?
refroidit => bloc de paraffine dur => coupé =>conservation dizaines d’années
technique de réalisation coupes en paraffine
combiend e temps dure l’étape de l’inclusion ?
entre 36 et 48 heures c’est long
technique de réalisation coupes en paraffine
comment est coupé le bloc de paraffine ?
en lames fines : 4 à6 μm à l’aide d’une microtome
technique de réalisation coupes en paraffine
comment on va faire la coupe avec la microtome ?
on fait fondre légerement le bloc de paraffin pour le ramollir
technique de réalisation coupes en paraffine
comment on pourra couper lame de tissus minéraus =os car le microtome ne peut pas les découer ?
ils sauront préalablement décalcifiés à l’aide d’un acide faible
technique de réalisation coupes en paraffine
comment se passe la coloration ?
- bains de toluène pour supprimer paraffine
- bains alcool de C° décroisssante pr réhydrater lame
- bainde colorant en s° aqueuse
- rinçage à l’eau pour éliminer excédent d’alcool
◊
que permet ma coloration ?
accentuer le contraste pour mieux visualiser les ≠ éléments
technique de réalisation coupes en paraffine
peut-on utilise pls colorants ?
oui svt on en utilise 2 voire 3
technique de réalisation coupes en paraffine
comment se fait le montage ?
on déhydrate à nouveau avec bains alcools c° croissante puis bains de toluène
technique de réalisation coupes en paraffine
que va-t-on déposer entre la lame et la lamelle ?
- une résine liquide hydrophobe d’indice de rérfaction identique au verre déposé sur préparation
- on peut aussi utliser goutte d’huile quand on utilise objectif à immersion
technique de réalisation coupes en paraffine
que permet la résine de liq hydrophobe ?
- de tenir en place la lame et la lamelle
- protéger materiel observer
- consercer préparation colorées
- améliorer visibilité microscope (indice de réfraction identique)
- but : optique et conservation
quels sont les avantages de la technique de coupe de paraffine ?
- conservation des structures
- qualités des images très bonne
quels sont les incovénients de la technique de coupe de paraffine ?
- lent
- fixation immédiate après prélevemnt matériel
- petites molé libres comme EE sont dissoutes ds ≠ bains
- lipides dissous ds bains de solvants organique
- fixation =>arrêt activité biologique=>enzymatiques
- fixation modifie conformation des molé surtt pro =>pertube reconnaisse Ac
Quels étapes sont supprimés pour la technique de réalisation des coupes en congélation ?
pas de fixation ni d’inclusion
comment se passe la rélaisation coupes en congélation ?
- coupes de tissu congelées à l’aire d’un cry-microtome cers -20°C
- coloration rapide avec bleu de Toluidine par ex
Quels sont les avantages de la techniques des coupes en congélation ?
- rapide
- permet examne extemporané d’un prélevment fait en salle d’opération
- maintient activité biochimique => réalisation par la suite histo-enzymmologie ou une immuno-histologie
- met en évident molé non observables en histologie classique
☞lipide ->colorbale par noir de soudan
☞petites molécules
☞antigène
Quels sont les inconvénients de la techniques des coupes en congélation
coupes de qualité médiocre
aucune conservation dans le temps possibles
les coloration vitales peuvent se faire sur qui ?
sur tissus dont les cell restent vivantes durant l’étude : ne sont peu ou pas toxique
coloration vitales
quels sont les ≠ types de colorants ?
- colorant phagocyté
- colorant diffusant à travers les mb
- colorants colorant cell mortes par perméabilité mbaire
coloration vitales
ex de colorants phagocytés ?
- encre de chine qui let en évidence des cell mononuclées du système phagocytaire
coloration vitales
ex de colorant diffusant à travers les mb ?
le bleu de Nil
coloration vitales
ex de colorants colorant les cell mortes ?
l’éosine nigrosine utiliser pour étudier vitalité des spz
les coloration générales
c’est quoi la métachromasie ?
propriétés d’un colorant à changer de couleur en fonction du pH des molé cur lesquelles il s’est fixé
les coloration générales
ex de colorant métachromasie ?
bleu de toluidin
les coloration générales
quels sont les 2 types de colorants ?
- colorants acides
- les colorants basiques
les coloration générales
que font les colorants acides ?
il se fixent sur des molécules basiques comme les prot cytoplasmiques. donc ils colorent les molécules basqiue donc struture acidophile =>colorant aionique
les coloration générales
ex de colorants acides ?
- erythrosine
- éosine
- orange G
les coloration générales
les colorants basiques se fixent sur quoi ?
molé acides comme acide nucléique =>colorent molé acide = tissu basophile => colorant cationique
les coloration générales
purqquoi en pratique on associe 2 ou 3 colorants ?
- pour les coupes
- pour les frottis sanguins
les coloration générales
ex de colorant utilisé pour les coupes ?
- hématéine
- érythrosine
- hématie-éosine
- safran
- l’hématéine érythrosine-safran
*
les coloration générales
ex de colorant pour les frottis sanguins ?
May Grünwald-Giemsa MGG =>structure cytoplasmique sera bleue et le noyau pourpre
que permet l’hybridation in situ ?
mise en évidence de séquences définies d’ADN ou d’ARN
que va-t-on utiliser pour hybridation in situ ?
- sondes d’acides nucléiques marquées, déposée sur lames elles vont se fixer sur séquences d’ADN complémentaires
- si segment d’ADN absent les sondes ne s’accroxheront pas
hybridation in situ
les sonde et l’ADN cible vont préablement … ?
dénaturés par la chaleur doubble brin->simple brin
hybridation in situ
comment peut se faire le marquage des ondes ?
- par isotopes (rare)
- par colorant fluorescent ex FISH: fluorescent in situ hybridation
que permettenet de mettre en évident les colorations histochimiques ?
in site les ≠ constituants que st les prot, les glucides, les acides nucléiques, les métaux
colorations histochimiques
que permet la technique du PAS ?
- Periodic Acid Schiff
- met en évidence les sucres complexes grace à la fuschine
colorations histochimiques
que permet la technique de Feulgen-Rosenbeck ?
met en évident l’ADN : colorations proportionnelle à la quantité d’ADN présente
colorations histochimiques
pourquoi on utilise les colorations argentiques ?
pour mise en évidence de la mélanine des amines biogènes et des neurofibrilles
colorations histochimiques
que met en évidence la coloration Perl’s ?
le fer
que permet l’histo-enzymologie ?
rechercher une activité enzymatique et donc de mettre en écidence présence d’enzymes
sur quel materiel on peut utiliser l’histo-enzymologie ?
- frais ou congelé car il ne doit pas être fixé
- nécessaire que produit de la réactino enzymatique soir insoluble et coloré
que met en écidence l’histo-enzymologie ?
- les peroxydase
- phosphatases
- éstérases
que permet l’immuno histochimie ?
de localiser les prot dans une cell
immuno histochimie
comment se fait la localisation des prot dans la cell ?
- via des Ac de la famille des immunoglonulines, produits par lymphocyte B et réagissant à des Ag
- Ac liaison très spécifique avec les prot
immuno histochimie
comment peuvent être les Ac spécifiques comme les immunoglobulines ?
- polyclonaux =>ils se fixent sut yous les épitopes d’un Ag
- monoclonaux=> ils se fixent sur nu seul épitopes
immuno histochimie
où sont récupérés les Ac polyclonaux ?
dna sle serum d’un animal immunisé
immuno histochimie
comment sont récupérés les Ac monoclonaux ?
ils sont produits in vitro à partir d’un clone plasmocyte d’origine animale fusionnée à une cell de la lignée d’un lymphocyte tumoral permettant de produire une immense quantioté d’Ac
immuno histochimie
commetn peut se faire le marquage des Ac ?
par immunofluorescence direct ou indirecte
immuno histochimie
comment ce passe immunofluorescence directe ?
- utilisation Ac cuplé à molé fluorescente
- observe échantillon en épifluorescence
- sur Ag il existe un site de fixation pour Ac spécifique
- au microscope on peut visualiser sur la préparation où les Ac se sont spécifiquement liés à Ag
À quoi on couple l’Ac en immunofluorescence indirecte ?
à un Ac secondaire dirigé spécifiquement contre les immunoglobulines sur lequel on place molé fluorescente
immuno histochimie_immunofluorescence indirecte
à quoi va se fixer l’Ac secondaire?
à Ac primaire => marquage réalisé seron multiples
immuno histochimie_immunofluorescence indirecte
pourquoi on dit qu’on aura marquages réalisé spécifiques ?
car sur Ag on trouve site de fixation pour Ac primaire et pls sites de fixation pour Ac secondaires sur Ac primaires
Pq l’immufluorescence indirecte est meilleure que la fluorescence direct ?
car on a pls sources fluorescente => confort d’analyse plus important
