Méthodes d'études de la cell_MET Flashcards
c'est le cours de montier
1
Q
la biologie cellulaire c’est quoi comme science ?
A
science des lois régissant phénomènes communs aux ≠ types de cell
2
Q
quel est le but de la biologie cellulaire ?
A
préciser les relations entre les structures que l’on peut observer en microscopie et leurs fontion
3
Q
de combien de cell et de bact un individu de 70kg est consitué ?
A
10¹³ cellules et 10¹⁴ bactéries
4
Q
chaque cell à un génome de combien de paires de bases ?
A
≈ ⒊10⁹
5
Q
quel est l’élement de fonctionnalité du génome ?
A
la prot => 10 à 20 millons de prot ≠
6
Q
que va t-on utiliser pour étudier les cell sachant qu’il y a pls structures ds cell et pls types de cell ?
A
on utilise un modèle cellulaire
7
Q
que permet de décrire le modèle cellulaire ?
A
une cell classique même si il n’en existe pas
8
Q
la cell c’est l’unité…?
A
structurale et fonctionnelle du vivant
9
Q
la cell est-elle capabel de vivre isolé ?
A
oui, elle a sa propre homéostasie
10
Q
que veut dire le terme homéostasie ?
A
capacité d’un système à maintenir l’équilibre de son milieu intérieur, quelles que soient les contraintes externes
11
Q
que doivent faire continuellemnt les cell ?
A
répondre aux besoins de l’oirgnaisme et être receptive
12
Q
la cell est-elle capable de se rerpoduire ?
A
oui et peut même s’associer => organismes supérieurs
13
Q
la cell est-elle un organisme vivant et dynamique ?
A
oui, elles peuvent aussi produire certaines substances qui vont influencer l’organisme
14
Q
quels sont les outils permettant de pouvoir oobserver la cell puisqu’elle est de petite taille ?
A
- le microscope optique
- le microscope électronique
15
Q
de quoi est à l’origine le MO ?
A
de la théorie cellulaire => = théorie d’organisation d’une popo cellulaire
16
Q
qu’à permi de définir le ME ?
A
l’ultrastructure des cell et les organtites intracellulaire
17
Q
que permet de classifié la théorie cellualire ?
A
classification des êtres vivants :
* en procarytoe => abct pas de noyau pas de matériel géntique délimité par mb nuléaire
* eucaryote => noyau contenant le matériel génétique, délimité
par une membrane nucléaire
18
Q
comment appelle-t-on les animaux eucaryotes unicellualires ?
A
protozoaires
19
Q
comment appelle-t-on les végétaux eucaryotes unicellulaires ?
A
protophytes
20
Q
comment appelle-t-on les animaux eucaryotes pluricellualires ?
A
métazoaires =>hommes
21
Q
comment appelle-t-on les végétaux eucaryotes pluricellulaire ?
A
métaphytes
22
Q
que va coder un gène ?
A
un message→pour construire prot→assure fonction→réguler gène
23
Q
quels sont les 3 étapes pour l’isolement des cell ?
A
- dissociation mécanique
- dissociation enzymatique
- identification des cell et enrichissemt des ≠ pop cellulaire
24
Q
c’est quoi la dissociation mécanique des tissus ?
A
disoociation grossière mais nécéssaire => macroscopique
25
que permet la dissociation enzymatique = par des prot ?
permet d'obtenir cell isolées
26
quel enzymes on utilise pour dissocier cell de la MEC ?
enzymes portéolytiques → digèrenet MES
27
quel enzyme on va utiliser pour dissocier des cell de jonction ?
utilisation agents chélateurs (= emprisonneurs) du Ca²⁺ →dissociation chimique
28
comment se fair l'identification des cell et l'enrichissement des ≠ pop cellulaire ?
* aux ≠ propriétés physique : taille, adhérence, ensité
* utilisation d'Ac spécifiques couplés à un support ou à un colorant fluorescent = fluorochrome pour cytomère en flux/trix = FACS
* à la microdissection laser
29
quel est le ppe de la centrifugation sur gradie de densité ?
séparer les cellules d’un tissu selon leur densité
| méthode d’analyse très
fréquente par ex pour analyser les lymphocytes
30
comment fonctionne la technique Ac couplé à un support ?
Ac monoclonal couplé à un support ou à un colorant fluorescent va venir reconnaître un antigène situé à l'extérieur de la cellule
31
À quoi peut couplé un Ac ?
* collagène
* colonne de billes de polysaccarides
* colonne aimantée
32
que permet la technique : Ac couplé à un support ?
**repérer un antigène** qui doit se trouver à la surface de la cellule
(= sur sa membrane). Elle ne permet pas de séparer des cellules en fonction de ce qu’il y a à l’intérieur de celles-ci :on l'**isole**
33
que veut dire FACS ?
Fluorescence Acivates Cell Sorter
34
que permet la cytométrie de flux/ FACS ?
d’analyser les cellules
individuellement et de façon automatique
=> comptage possible
35
que va pouvoir mesurer le FACS ?
propriétés optiques :
* taille
* complexité interne de cellules transportées dans un liquide vecteur :flux jusqu’à une source
d’excitation lumineuse :laser
36
À quoi peut-on associer le FACs ?
un trieur pour séparer les ≠ pop cellulaires
37
que veut dire Laser ?
= Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation = **photons** ≠
électrons
38
quels sont les avantages de la cytométrie de flux ou FACS ?
* rapidité : 10000cell en qq min
* application au cell vivante : taille, compléxité interne
* trier cell en fonction activité cellulaire : suivant angle de diffraction de la lumière qui les traverse
* haut débit pls milliers de cell
* intégration de pls paramèter etmarquages multiple
* cell peuvent être remises en culture
39
comment est la cell si on a un petit angle de diffraction ?
**cellule en pleine activité** dont la
complexité interne est grande (beaucoup de Golgi et de RE) → beaucoup de
faisceaux sont déviés.
40
comment est la cell si on a un grand nombre de diffraction ?
on a une cellule en activité plus calme dont
complexité interne est plus faible → beaucoup de lumière la traverse
41
que permet l'intégration de pls paramètre et des marquages multiples ?
permettant d’isoler pop très spécifiques→ l’obtent° d’une pop la plus identique
possible permet le transfert sur les malades
42
comment fonctionnel la cytométrie de flux / FAC ?
pop de cell passe ds chambre→emission LASER en fonction exctiation LASER+ incidence sur cell pn détermine ctn nombre d'éléments la concernant
43
que ce passe-t-il pour le LASER si on utilise un fluorochrome pour une cytométrie de flux?
LASER va toucher la cellule marquée et émettre une longueur
d’onde d’émission dans une autre gamme de fréquences → repérage des cellules.
44
que permet l'utilisation du fluorochrome en sytométrie de flux ?
* L’**étude du cycle cellulaire** (ex : population tumorale), en prenant en compte la variation de la quantité d’ADN d’une cellule diploïde
* D**’isoler les sous-populations pures** et stériles en vue d’autres études (ex : culture
cellulaire).
* La quantification et la répartition de sous-populations cellulaires (ex : cellules **Natural Killer** = cellules qui « tuent » les cellules cancéreuses)
45
comment on peut réussier à quantifier l'ADN en FACS ?
la liaison stœchiométrique entre l’iodure de propidium (= **DAPI**) et l’ADN ainsi que l’**intensité de la fluorescence** qui permettent de
quantifier l’ADN de chaque cellule et de repérer la position dans le cycle cellulaire
46
que permet la microdissection laser ?
prélever quelques cellules dans une coupe de tissu et est
utile pour étudier un seul type cellulaire
| existe aussi pour prélever quelques cellules sur un tissu vivant
47
quel est l'inconvenient d'utiliser la microddissection laser ?
risque d'abimer le tissu à causes des brülures du laser
48
pour quel tissu il est inutile d'utiliser la microdissection laser ?
sur du tissu hématopoïétique car les cell y sont indépendantes
49
la culture celluaire c'est quoi ?
maintien in vitro des cellules pendant une **durée variable**
| la durée dépend de la nature des cellules
50
comment peut se faire la culture des cell ?
* milieu classique
* milieux chimiquement définis sans sérum SVF
51
c'est quoi un milieux classiques pour la culture des cell ?
T° de 37°C, on peut y mettre des **substances nutritives** élémentaires (eau, acides aminés, glucose, vitamines, sels/ions, oligoéléments) et des **suppléments pour la division** comme le *sérum de veau fœtal* SVF (hormones, facteurs de croissance, protéines, lipides, …)
52
pour quel type de sell on utilise milieux de cultures classiques ?
pour des cellules lambda - ex : cellules cancéreuses
53
pour quelle type de type on utiliser des milieux chimiquement défnins sans sérum ?
pour des cellules très
différenciées / difficiles à maintenir en vie
54
c'est quoi un milieux chimiquement définis sans sérum ?
On y met les **substances nutritives** de base avec de l’*insuline, de la transferrine* (= protéine transporteuse de fer) et de *l’albumine*. Des **facteurs de croissance** spécifiques comme *l'EGF* (= endothélial growth factor), la *NGF *(= neuronal growth factor) et *l’IL-2* (= interleukine 2) font aussi partie du milieu.
55
que va-t-on ajouter dans les milieux stériles pour cultures des cell ?
un indicateur coloré : le rouge phénol.
56
comment on sait que milieu est acide ?
il y a division =>détection d'infection bact car elles produisent acide lactique ->↘︎pH
57
quel est l'objectif si on fait un élevage dans stérilité ?
réinjecter les cellules au patient par
la suite
58
comment se fait un élevage dans la stérilité ?
à 37°C et avec un CO2 à 5% (idem à l’atmosphère)
59
comment sont manipulés les milieux de culture ?
avec un incubateur et sous une hotte
60
Quand est-ce que les élevages dans la stérilité sont utilisé ?
pour la FIV, les vaccins, la thérapie cellulaire, la production de molé ect
61
que fait-on quand il ya culture primaire ?
il s’agit d’aller prélever une cellule dans un organisme pluricellulaire et de
la cultiver in vitro
62
les cultures prilaires sont elles immortelles ?
non , elles tiennent une semaine max => cell soumises phénomène de sénescence ± rapidemnt avec ↘︎÷
| sénescence= vieillissement et mort des cell
63
que va-t-on effectuer si on a des cell qui ont du mal à croître ?
passage/repiquage nécessaire: on repique les cell ds nouvelle boîte de culture avec un milieu de
culture neuf (= culture secondaire)
64
les cell in vitro expriment-elles les mêmes propiétes de laur tissu d'origine ?
oui
65
comment sont les cell normales en cultures ?
* prolifération controlée
* nbre limité de ÷ voire pas de ÷
66
pourquoi les cell normales en cultue n'ont que voire pas du tout de ÷?
**raccourcissements des télomères** (perte de 40-200 nucléotides par division) qui ne peuvent ainsi plus jouer leur rôle de protecteur de l’ADN
67
que ce passe-t-il quand le télomères devient trop court ?
cell l'interprète comme corruption de son ADN et entre alors sénescence(=apoptose).
68
Au bout de combien de ÷ peut avoir lieu la sénescence de la cell ?
2 à 3 divisions pour les cellules musculaires,
contre 50 pour les fibroblastes (→ peuvent être utilisés pour une culture secondaire)
69
comment sont les cell cancéreuses en culture ?
* pas de controle
* pas d'ancrage nécessaire, peu de facteurs de croissa,ce / perte d'inhibition de contact due à dédifférenciation
* immortelles =>télomérase très active
70
c'est quoi le métastase ?
foyer de cell cancéreuse
71
c'est quoi la télomérase ?
* enzyme et un complexe ribonucléoprotéique (protéines + ARN)
* télomérase humaine est formée de 2 sous-unités
72
quels sont les 2 sous unités de la Télomérase ?
TERT (sous-unité protéique) : TElomerase Reverse Transcriptase
- TERC (sous-unité ARN) : TElomerase RNA Component
| maintiennent la longueur des télomères
73
les cell isolées à partir de tumeurs peuvent-ells ^tre répiqués de nbrse fois ?
oui on peut alors créer des lignées cellulaires
74
quelle est la 1ère lignée cellulaire à avoir été crée à partir de cell cancéreuses ?
= lignée HeLa en 1952 =>élaborée à partir cell épithéliales issus d'un cancer du col de l'utérus
75
par quoi peuvent être transformés les cell normales ?
virus ou des mutations oncogènes
(= gènes responsables de la division cellulaire) et ainsi devenir immortelles ->évite entrée en senescence
76
les cancer peuvent-ils être dus à des virus ?
oui , selon OMS 15 à 20 % des cancers
77
les cultures permettent d'obtenir quoi ?
cell en très grand nombre + étudier influence du milieu + intéraction cellulaires gra^ce aux co-culture
78
pourquoi on clone des cell mutantes ?
r étudier le contrôle du cycle de division cellulaire (CDC).
79
# clone cellulaire
que modèle on peut prendre comme ex de clone cell mutante ?
* les levures des protophyte eucaryotes
* Le produit du gène mutant est
fonctionnel à température permissive et non-fonctionnel en conditions restrictives
80
# clones cellulaire
pourquoi on utilise l'oeuf de xénope 🐸?
* utilisé pour tester l’impact tératogène des
médicaments
* études d'embryogenèse + découverte des anticorps monoclonaux ayant permis une aide à
l’étude et une utilisation en thérapie
81
quel est la résolution de l'oei nu ?
0,2 mm
82
résolution du MO ?
0,2 μm donc 200 nm
83
résolution du ME ?
2nm en MET et 10nm en MEB pour coupes biologique
84
quelles sont les ordres de grandeurs des ut-nités biologiques structurales ?
* L’atome mesure 0,2 nm (= 2 Å)
* Le virus, 100 nm (adénovirus plutôt gros / rétrovirus plutôt petits)
* la bactérie, 1 μm
* La mitochondrie, 1 μm → facile à voir en MO
* La cellule eucaryote, 10 à 30 μm (/!\ 5 à 30 μm pour M. Blondel) → on retient une dizaine de microns
85
à quoi correspond la résolution d'une lentille de microscope ?
équivaut numériquement à D, c’est-à-dire à la
distance minimale entre 2 objets distinguables
86
comment on peut ↗︎ la résolution ?
en utilisant longeurs d'onde inférieures ou C° super de la lumière
87
↗︎ pouvoir de résolution c'est …?
↘︎ la limite de résolution
88
que met-on en place pour mieux voir les cell au microscope photoniques ?
des coloration sur cell fixées =>inconvénient es conclusions peuvent être erronées) avec ± d’immunomarquage
| immunomarquage =tuilisation d'Ac marqués pour identifier une molé
89
quels sont les autres techniques pour pouvoir observer cell vivante en microscope photonique ?
* contraste de phase
* contraste interférentiel
90
fera-t-on un coupe de tissu pour le MEB ?
NON
91
comment faitr pour avoir une vision correcte et pouvoir observer les détails les plus fins ?
on ↗︎ résolution et on passe au ME
92
À quoi est proportionnelle la résolution
à la longeure d'onde de la radiation utilisée pour interférer avec les structures
93
comment est la longueru d'ondes des e- comparé à celle des photons ?
λélectrons (10⁻³ à 1 nm) << λlumière visible ou photons (400 à 700 nm)
94
quelle longueur d'onde correspond à couelur bleue
380 nm
95
quelle longeur d'onde correspond à la couleur rouge ?
650 nm
96
que ce passe-t-il pour la longueru d'onde plus la vse des e- est élevé ?
elle diminue
97
quel est le pouvoir de résolution du MET ?
2nm soit x100 MO
98
que permet utilisation d'huile à immersion ?
permet **d'augmenter indice de réfraction ** du milieu présent entre le spécimen et la lentille objectif
99
que peut-on voir en en ME ?
objets très petits et donne des images avec des
détails voire des représentations en 3D
100
quelle est la préparation pour réaliser pour le MET ?
* fixation
* coupes très fines
| uniquement pour MET car MEB pas de coupes
101
que permet d'observer le MET ?
interieur de la cell
102
que va donner le MEB ?
des représentation en 3D de entité observée ☞bosses
103
quelle est le grossissemnt du microscope électronique à transmission ?
| MET
x1 500 jusqu’à x500 000
104
limite de résolution du MET ?
2nm
105
comment fonction MET ?
on fait passer faisceau d’électrons, dans un environnement « rempli » de vide, à travers une coupe ultrafine (≈ 50 nm) d’un échantillon biologique, contrastée par un
dépôt métallique. Ce faisceau est ensuite agrandi par des électroaimants et vient former une
image sur un écran fluorescent ou sur un film photographique
106
comment est appelée la source dnas le MET ?
* c'est une cathode :e-
* situés au sommet d'un colonne 1à 2 m
107
que permet le vide ?
l'accélération des e-
108
que permettent les bobines magnétiques du MET ?
condensent les e-
109
Où est placé l'échantillon dnas le MET ?
sur la grille : coloration se fait averc materiau dense aux e- et est sombre pour une déviation pour sutructure biologique
110
quel est el grossissement du microscope électronique à balayage (MEB) ?
x20 à x400000
111
limite de résolution du MEB ?
≥10 nm
112
profondeur de champ au MEB ?
qq mm =>permet effet de relief
113
quel est le ppe du MEB ?
électrons sont réfléchis sur l’objet et
repris par un détecteur. Les dessiccations (l'eau est retirée) se font sans rétraction et on y dépose de l’or.
114
comment on prépare un échnatillons pour aller dnas le MEB ?
1. Prélèvement
2. fixation au glutaraldéhyde
3. déshydratation à acétone
4. métallisation avec soit or ou platine
115
que va-t-on observer au MEB ?
* image tridimensionnelle où on observe cell intacte mais morte + constituants cellualires
116
que va-t-on faire si on fait MET par cryofracture ?
cell congelée très rapidement à -196°=>azote liquide
117
Pour quel élemnt de la cell on va utiliser Technique de MET par cryofracture?
pour les mb cellualire : on sépare les deux hémi-couches de la membrane cellulaire. Sur chaque
moitié, on applique un ombrage et une réplique (visualisation de l’intérieur)
118
que permet l'observation au MET d'une mb ?
montre les particules intramembranaires. donc étude de l'ultrastructure des composant cellualires en évitant une partie des artéfact causés par fixation
119
que peut-on voir au ME ?
* constituants intracellulaires (organites, macromolécules spécifiques,
…)
* surface de l’échantillon (membrane post-cryofracture)
120
quel est le but du fractionnement sub cellulaire ?
séparer, isoler et purifier les organites et les macromolécules, sans les altérer,
pour étudier leurs fonctions.
121
quelle est la 1ère étape à faire pour fractionnement subcellualire ?
homogénéise le mélange en rompant la membrane plasmique
122
# fractionnement subcellulaire
comment peut-on rompre la mb plasmqie ?
* **Choc osmotique** (= on joue sur les concentrations en sels) ou **ultrason**s (= dégraissage agissant sur les lipides).
* **Choc mécanique** (Potter).
123
# Fractionnement subcellulaire
quelle est la 2ème étape du Fractionnement subcellulaire?
centrifuge et ultracentrifuge avec des vitesses croissantes : les constituants de grande taille ou de grande densité sédimentent en premier (noyau → mit → …)
124
c'est quoi le surnageant au bout de 20 min ?
mit, lysosomes , peroxysome
125
c'est quoi le surnageant au bout de 60 min ?
Fragments de mb , RE fragmenté
126
c'est quoi le surnageant au bout de 3 h ?
ribosomes, virus, macromolécules
127
quel est le temps de fragmentation subcelluliare par centrifugation ?
cumulé : 10 min+20min+60min+3h= 4h30
128
peut on faire la spération des organite en un seul temps ?
oui avec la sédimentation à l'éq => grâce au **gradienr de sucrose**
129
comment se passe la séparation des organites avec un. gradient de sucrose ?
plusieurs couches de sucrose de
densités différentes donc les ≠ organites vont se placer entre les deux couches de
densité voisine par ultracentrifugation
130
Étapes de la séparation avec le gradient de sucrose ?
1. Lyse cellulaire (ultrasons, broyage, choc osmotique, …)
2. Dépôt du lysat sur gradient de sucrose
3. Centrifugation à très haute vitesse (ultracentrifugation)
4. Séparation des différentes structures en fonction de leur densité.
131
comment vont être récupéres les couches lors de la séparation des organite avec gradient de sucrose ?
avev aiguille spéciale qui aspire la zone qui nous interesse
132
pour quoi on utilise le gradient de Ficoll ?
pour sépare les cell qui composent un tissu => même procédés que pour gradient de sucrose
133
de quoi dépend la centrifugation ?
du coeff de sédimentation = vse à laquelle un constituant se sédimente
134
comment s'exprime le coeff de sédimentation ?
en Svedberg (S)
135
le coeff de sédimentatione st-il en lie avev le poids moléculaire ?
non mais avec taielle et forme des obt
136
le coef de sédimentation est-il additif ?
non car :
Pour les ribosomes 80S
* Une grande sous unité à 60S (ARNr 5S, ARNr 28S, ARNr 5,8S et des protéines)
* Une petite sous unité à 40S (ARNr 18S et des protéines).
et 40 S+60 S ≠ 80S
137
combien mesure l'ADN ?
1,80 m ce qui correspond à 6.10⁹ nucléotides donc 3.10³
138
quel est la techinque pour analyser l'ADN ?
Southern blot
139
quel est la techinque pour analyser ARN ?
Northern blot
140
quel est la techinque pour analyser prot ?
Western blot
141
comment se déroule les ≠ technique S,W,N blot ?
1. Électrophorèse
2. transfert sur un flitre par capillarité ->transfert électrique
3. Hybridation avec sonde spécifique
4. Révelation
142
c'est quoi l'électrophorèse ?
on sépare les composants selon les
poids moléculaires. => les grosses molécules auront plus de mal à migrer que les petites → séparation.
143
que va-t-on utiliser pour la révélation ?
* Une **chromatographie** (de partage, affinité, …)
* Une **électrophorèse** sur gel de polyacrylamide (SDS PAGE) en 2 dimensions (poids
moléculaire et pHi = pH isoélectrique)
* Un **séquençage des protéines** (cristallographie ou RMN) → révèle la forme et donc la
fonction (car elles sont liées)
144
comment est estimé le poids moléculaire de ADN et ANR ?
par électrophorèse sur gel
145
comment on va étudier les cell vivante ?
avec prot chiméres fluorescente
146
comment on va étudier les cell vivantes avec des prot chimères ?
* construction gène codant pour prot d'intérêt en ajoutant GFP =>prot fluo
* transfection
* gène ensuite transcrit en ARNm et traduit en prot dnas le REG
* permet visualisation cellulaire grâce à la GFP svt au microscope confoncal
147
# Étude des cellules vivantes
Les protéines chimères
comment fonctionne la tras-nsfection ,
on introduitle gène codant et la GFP ds cell avec vecteur car besoin d'aidepour passer comme prot , ADN et mb chargée négativement
| Green Fluorescent Protein ; issue d’une
méduse
148
que permettent les précurseurs ?
des études cinétique
149
comment peuvent être les précurseurs ?
* radioactifs : on les révelent ar autoradiographie
* ou autre ex: fluorochromes
150
précureseurs radioactifs ?
* Le **³H-thymidine** : l’ADN est synthétisé dans le noyau et y reste
* Le **³H-uridine** : l’ARN est synthétisé dans le noyau et migre dans le cytoplasme
(pas d’uridine dans l’ADN)
* **³H-leucine** : « pulse-chase » des protéines du RE vers le Golgi (sécrétion)
151
quel est le nom de la méthode quand on utilise un flux d'ions à travers les mb ?
" patch-clamp "
152
comment on réalise la méthode du patch-clamp ?
utilise une pipette en verre (Ø < 1 μm) posée à la
surface d’une cellule et on isole un « patch » (canal ionique).
153
une fois qu'on a isoler le patch que fait-on ?
électrodes sont reliées à un système d’enregistrement qui prend en compte les variations de tension imposées. S’il y a un passage d’ions, il y a un potentiel de membrane. Cela précise les conditions électro-physiologiques pour l’état d’ouverture ou de fermeture des canaux
ioniques (flux ioniques).
