Lezione 8 Flashcards
1
Q
Che cosa è la traduzione nella biologia molecolare?
A
La traduzione è l’ultima parte del dogma centrale della biologia in cui la sintesi proteica avviene nei ribosomi, composti da proteine e RNA.
2
Q
Dove avviene la sintesi proteica nella cellula?
A
La sintesi proteica avviene nei ribosomi, che si trovano nel citoplasma o attaccati al reticolo endoplasmatico ruvido (RER).
3
Q
Qual è la differenza tra i ribosomi procariotici e eucariotici?
A
I ribosomi procariotici sono 70S, composti da subunità di 50S e 30S, mentre i ribosomi eucariotici sono 80S, composti da subunità di 60S e 40S.
4
Q
Quali sono le componenti delle subunità dei ribosomi procariotici?
A
La subunità maggiore (50S) contiene 34 proteine e rRNA 23S e 5S, mentre la subunità minore (30S) contiene 21 proteine e rRNA 16S.
5
Q
Quali sono le componenti delle subunità dei ribosomi eucariotici?
A
La subunità maggiore (60S) contiene 49 proteine e rRNA 28S, 5S, 5.8S, mentre la subunità minore (40S) contiene 33 proteine e rRNA 18S.
6
Q
Come sono organizzati i geni che codificano per i ribosomi?
A
I geni per i ribosomi sono sequenze ripetute in tandem su cromosomi acrocentrici (13, 14, 15, 21, 22), con circa 400 unità nel genoma umano.
7
Q
Quali RNA polimerasi trascrivono gli rRNA?
A
Gli rRNA dei ribosomi sono trascritti dall’RNA-Pol-I, mentre l’RNA 5S è trascritto dall’RNA-Pol-III.
8
Q
Quali sono gli ingredienti della traduzione?
A
Gli ingredienti della traduzione sono: ribosomi, tRNA e mRNA.
9
Q
Qual è la funzione dell’rRNA 16S nei ribosomi?
A
L’rRNA 16S interagisce con l’mRNA e gli anticodoni dei tRNA per controllare il corretto appaiamento mRNA-tRNA nei siti A e P.
10
Q
Qual è la funzione dell’rRNA 25S nei ribosomi?
A
L’rRNA 25S ha attività peptidil-transferasica, essenziale per la formazione dei legami peptidici durante la sintesi proteica.
11
Q
Qual è la funzione del tRNA durante la traduzione?
A
Il tRNA trasporta gli amminoacidi al ribosoma e decodifica l’informazione presente sull’mRNA per costruire la proteina.
12
Q
Qual è l’orientamento dell’mRNA durante la traduzione?
A
L’mRNA è orientato in direzione 5’ → 3’ durante la traduzione.
13
Q
Come avviene il riconoscimento tra codone e anticodone?
A
Il riconoscimento avviene tramite l’anticodone del tRNA, che si appaia con il codone complementare sull’mRNA.
14
Q
Quali sono i tre siti presenti nei ribosomi?
A
I ribosomi presentano tre siti: Sito A (arrival), Sito P (peptidil), Sito E (exit).
15
Q
Qual è la funzione del sito A nei ribosomi?
A
Nel sito A entra il tRNA che riconosce il codone sull’mRNA.
16
Q
Qual è la funzione del sito P nei ribosomi?
A
Nel sito P si forma il legame peptidico tra due amminoacidi.
17
Q
Qual è la funzione del sito E nei ribosomi?
A
Nel sito E si lega il tRNA scarico che poi si allontana dal ribosoma.
18
Q
Come avviene l’attivazione dell’amminoacido nel tRNA?
A
L’amminoacido è legato al tRNA dall’amminoacil-tRNA-sintetasi, che seleziona l’amminoacido corretto e lo lega all’estremità 3’ del tRNA.
19
Q
Cos’è il complesso amminoacil-tRNA?
A
È il complesso formato da un tRNA carico con l’amminoacido corretto, pronto per riconoscere un codone sull’mRNA.
20
Q
Qual è la funzione della posizione vacillante (wobbling position)?
A
La posizione vacillante si riferisce alla terza base del codone che può appaiarsi in modo non canonico con l’anticodone del tRNA.
21
Q
Quali sono le tre fasi della traduzione?
A
Le tre fasi della traduzione sono: Inizio, Allungamento e Terminazione.
22
Q
Qual è la funzione dei poliribosomi/polisomi negli eucarioti?
A
I poliribosomi/polisomi consentono di ricominciare rapidamente la traduzione della stessa proteina grazie alla vicinanza dei ribosomi, formando una struttura circolare.
23
Q
Quali sono le principali componenti che formano la struttura circolare dei poliribosomi negli eucarioti?
A
La struttura circolare è formata dal CAP 5’ che si lega alla coda di poli-A 3’ tramite PABP e il fattore di traduzione eIF4E, che recluta eIF4G.
24
Q
Qual è il ruolo del CAP 5’ e della coda di poli-A nella traduzione?
A
Il CAP 5’ e la coda di poli-A formano un ciclo grazie alla connessione mediata da PABP e eIF4G, facilitando l’inizio della traduzione e l’efficienza della sintesi proteica.
25
Quali sono i passaggi principali dell'inizio della traduzione negli eucarioti?
1. Formazione del complesso met-tRNA e fattori di inizio (eIF2 ed eIF3). 2. Caricamento del complesso 43S nella subunità ribosomiale minore sul sito P. 3. Riconoscimento dell'estremità 5' dell'mRNA e legame alla subunità minore. 4. Scivolamento dell'mRNA fino al primo AUG e formazione del complesso ribosomico.
26
Che cos'è la sequenza di Kozak e qual è la sua funzione?
La sequenza di Kozak (G/ANNAUGGC) è una sequenza di basi che facilita il riconoscimento del codone AUG da parte della subunità ribosomiale piccola e migliora l'efficienza della traduzione.
27
Qual è il 'degree of conservation' nella sequenza di Kozak?
Il 'degree of conservation' si riferisce alla conservazione particolare delle basi A o G nella sequenza di Kozak.
28
Come funziona la traduzione negli eucarioti una volta che la proteina è sintetizzata?
Dopo la sintesi della proteina, il ribosoma si stacca e le due subunità si dissociano, formando un pool di ribosomi liberi che possono avviare una nuova traduzione.
29
Come viene regolata la produzione di proteine negli eucarioti?
La produzione di proteine è regolata dalla quantità di mRNA presente nella cellula; l'mRNA può essere degradato, influenzando la produzione proteica.
30
Quali sono le differenze nella traduzione tra batteri e eucarioti?
Nei batteri, il primo amminoacido è formil-metionina e non vi è riconoscimento del CAP; si utilizza invece la sequenza Shine-Dalgarno per il riconoscimento dell'mRNA.
31
Cos'è la formil-metionina e come differisce dalla metionina normale?
La formil-metionina è una metionina modificata con un gruppo formilico, bloccando l'NH terminale, a differenza della metionina normale che non ha questo gruppo.
32
Che cos'è la sequenza Shine-Dalgarno?
La sequenza Shine-Dalgarno (AGG-AGG) è una sequenza di riconoscimento nei batteri, situata a circa 10 basi dall'AUG, e facilita l'inizio della traduzione.
33
Come funzionano gli mRNA policistronici nei batteri?
Gli mRNA policistronici nei batteri codificano per più proteine correlate, sintetizzate indipendentemente l'una dall'altra, consentendo una produzione proteica efficiente con un singolo mRNA.
34
Qual è il ruolo dei fattori di inizio della traduzione eIF2 ed eIF3 nel primo passaggio dell'inizio della traduzione negli eucarioti?
eIF2 ed eIF3 aiutano a formare il complesso iniziale con il met-tRNA e preparano la subunità ribosomiale minore per il riconoscimento dell'mRNA.
35
Qual è la funzione del complesso 43S nella traduzione eucariotica?
Il complesso 43S, formato dal met-tRNA e dai fattori di inizio, viene caricato nella subunità ribosomiale minore e si lega al sito P per avviare la scansione dell'mRNA.
36
Come avviene il riconoscimento dell'mRNA da parte della subunità ribosomiale minore?
La subunità ribosomiale minore riconosce l'estremità 5' dell'mRNA grazie a un complesso formato dal CAP 5' e dai fattori di inizio della traduzione, e si lega all'mRNA.
37
Qual è il meccanismo di scivolamento dell'mRNA fino al primo AUG durante l'inizio della traduzione?
Il complesso ribosomico scivola lungo l'mRNA in direzione 5' à 3' fino a trovare il primo AUG, dove si forma il complesso ribosomico e la traduzione inizia.
38
Quali sono le differenze specifiche nella sequenza Shine-Dalgarno rispetto alla sequenza di Kozak?
La sequenza Shine-Dalgarno nei batteri è AGG-AGG e si trova a circa 10 basi dall'AUG, mentre la sequenza di Kozak negli eucarioti è G/ANNAUGGC e si trova vicino al codone AUG per facilitare il riconoscimento.
39
Come influenzano le sequenze regolatorie nella traduzione dei batteri?
Le sequenze regolatorie, come Shine-Dalgarno, influenzano l'inizio della traduzione riconoscendo e legandosi all'mRNA, facilitando l'inizio della sintesi proteica nei batteri.
40
Quali tecniche sono utilizzate per identificare le sequenze di riconoscimento dei ribosomi nei batteri?
La tecnica di ribosome sequencing viene utilizzata per identificare le sequenze di riconoscimento; comporta l'estrazione dei ribosomi e la degradazione del materiale sporgente con nucleasi.
41
Qual è il ruolo del peptidil-tRNA nel sito P durante la traduzione?
Il peptidil-tRNA nel sito P del ribosoma trasporta la catena polipeptidica in crescita e forma legami peptidici con il nuovo amminoacido portato dal tRNA nel sito A.
42
Come funziona l'enzima peptidil-transferasi nella formazione del legame peptidico?
La peptidil-transferasi catalizza la formazione del legame peptidico tra il C-terminale del nuovo amminoacido e l'N-terminale della catena polipeptidica esistente, rompendo il legame estere tra il tRNA e il peptide e formando un legame ammidico.
43
Qual è il meccanismo dettagliato della traslocazione del ribosoma durante l'allungamento?
Durante la traslocazione, il ribosoma si sposta di 3 basi lungo l'mRNA. Il tRNA con la catena peptidica si sposta dal sito A al sito P, mentre il tRNA scarico si sposta dal sito P al sito E e viene rilasciato. Questo movimento è facilitato da GTP e dagli EF-Tu e EF-G nei batteri, o dagli eEF-1 e eEF-2 negli eucarioti.
44
Qual è la funzione del sito A del ribosoma durante l'allungamento della traduzione?
Il sito A del ribosoma è il sito di accoglienza per il tRNA carico di amminoacido. Qui, il tRNA si lega al codone corrispondente sull'mRNA e contribuisce alla formazione del legame peptidico.
45
Qual è la differenza tra i tRNA nel sito P e quelli nel sito A durante la traduzione?
Il tRNA nel sito P trasporta la catena peptidica in crescita e mantiene il peptide legato, mentre il tRNA nel sito A porta il nuovo amminoacido e si lega al codone corrispondente sull'mRNA per formare un nuovo legame peptidico.
46
Come avviene il meccanismo di verifica del codone-anticodone durante l'allungamento?
Il tRNA nel sito A deve avere un anticodone che corrisponde esattamente al codone dell'mRNA nel sito A. Questa interazione è verificata tramite l'allineamento tra codone e anticodone, garantendo che il giusto amminoacido venga aggiunto alla catena peptidica.
47
Qual è il ruolo dell'rRNA 16S nei batteri durante l'inizio della traduzione?
L'rRNA 16S dei ribosomi batterici interagisce con il codone di inizio dell'mRNA e con l'anticodone del tRNA iniziatore per garantire l'allineamento corretto del tRNA e l'mRNA.
48
Come viene gestito il primo amminoacido della catena nei batteri rispetto agli eucarioti?
Nei batteri, il primo amminoacido è la formil-metionina, che ha un gruppo formile aggiunto all'N-terminale. Negli eucarioti, il primo amminoacido è la metionina senza modifiche aggiuntive.
49
Qual è la funzione della sequenza di Kozak nella traduzione degli eucarioti?
La sequenza di Kozak, che comprende la sequenza G/ANNAUGGC, facilita il riconoscimento del codone AUG di inizio da parte della subunità ribosomiale minore e aumenta l'efficienza della traduzione.
50
Che cosa avviene se la sequenza di Kozak è assente o non ottimale?
Se la sequenza di Kozak è assente o non ottimale, la traduzione può essere meno efficiente, ma non viene completamente bloccata. La traduzione può comunque avvenire, ma con una minore efficienza.
51
Qual è la differenza nei meccanismi di terminazione tra eucarioti e procarioti?
Negli eucarioti, un unico fattore di rilascio (RF) riconosce tutti e tre i codoni di stop. Nei procarioti, due fattori di rilascio (eRF-1 e eRF-2) sono responsabili della riconoscenza dei diversi codoni di stop.
52
Come agiscono i fattori di rilascio nella terminazione della traduzione?
I fattori di rilascio si legano al sito A del ribosoma quando un codone di stop è presente. Questo impedisce la formazione di legami peptidici aggiuntivi e induce la peptidil-transferasi a idrolizzare la catena polipeptidica, causando il rilascio della proteina.
53
Che cosa succede al ribosoma e all'mRNA dopo la terminazione della traduzione?
Dopo la terminazione, la catena polipeptidica viene rilasciata, l'mRNA viene dissociato dal ribosoma, e le due subunità ribosomiali si separano, ricostituendo un pool di ribosomi liberi.
54
Qual è l'effetto della sequenza destabilizzante sull'mRNA nella terminazione della traduzione nei batteri?
Le sequenze destabilizzanti causano la dissociazione rapida del ribosoma dall'mRNA, poiché queste sequenze rendono l'mRNA instabile e accelerano il processo di terminazione.
55
Come contribuiscono gli eIF alla fase di inizio della traduzione negli eucarioti?
Gli eIF (fattori di inizio della traduzione) reclutano la subunità ribosomiale piccola, il tRNA iniziatore e la subunità ribosomiale grande, facilitano l'inizio della traduzione e assicurano che il ribosoma si leghi correttamente all'mRNA.
56
Che ruolo ha l'acido formico nella modificazione della metionina nei batteri?
L'acido formico si lega al gruppo amminico della metionina per formare la formil-metionina, che è il primo amminoacido incorporato durante la traduzione nei batteri.
57
Qual è la funzione del fattore eIF4G nel ciclo della traduzione eucariotica?
Il fattore eIF4G si lega sia al CAP 5’ dell'mRNA che alla coda di poli-A tramite PABP, facilitando la formazione di un anello di poliribosoma e accelerando la traduzione della stessa proteina.
58
Cos'è un Internal Ribosome Entry Site (IRES)?
L'IRES è una sequenza di RNA presente nell'mRNA che consente ai ribosomi di legarsi e iniziare la traduzione direttamente su questa sequenza, senza passare attraverso il CAP 5’ dell'mRNA.
59
Qual è la funzione principale dell'IRES negli mRNA virali?
Negli mRNA virali, l'IRES permette la traduzione di più proteine da un singolo mRNA, facilitando l'espressione di proteine polifunzionali o multi-cistroniche tipiche dei virus.
60
Come può l'IRES essere utilizzato come strumento di monitoraggio della traduzione?
L'IRES può essere utilizzato per inserire una proteina reporter, come la GFP, in un mRNA. Questo consente di monitorare l'espressione della proteina reporter in relazione alla traduzione della proteina principale, poiché entrambe vengono tradotte con uguale efficienza.
61
In quali condizioni l'IRES diventa particolarmente utile per la cellula?
Durante la mitosi, quando la traduzione del CAP 5’ è ridotta a causa della defosforilazione di eIF4E, l'IRES consente la traduzione di proteine essenziali che potrebbero essere bloccate in altre fasi del ciclo cellulare.
62
Qual è la funzione difensiva dell'IRES contro le infezioni virali?
Quando i virus distruggono eIF4G per impedire la traduzione dell'mRNA cellulare, l'IRES permette la traduzione di proteine cellulari essenziali, facilitando risposte anti-virali, come l'apoptosi o la produzione di proteine antivirali.
63
Cos'è il Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD)?
Il NMD è un meccanismo di controllo della qualità dell'mRNA che distrugge gli mRNA che contengono codoni di stop prematuri, generalmente causati da splicing errato o mutazioni.
64
Qual è il ruolo delle proteine che marcano i bordi esone-esone durante lo splicing?
Le proteine che marcano i bordi esone-esone servono a garantire che l'mRNA maturo sia corretto. Queste proteine rimangono attaccate ai bordi esone-esone mentre l'mRNA è nel citoplasma.
65
Cosa accade quando il ribosoma incontra uno stop-codon prima dell'ultimo esone?
Se il ribosoma incontra uno stop-codon prima dell'ultimo esone, segnala che l'mRNA è difettoso. Il ribosoma recluta esonucleasi per degradare l'mRNA, prevenendo la produzione di proteine errate.
66
Come il NMD riconosce e distrugge gli mRNA contenenti mutazioni nonsense?
Il NMD identifica mRNA contenenti codoni di stop prematuri, che si trovano prima dell'ultimo esone. Questi mRNA vengono degradati perché indicano errori di splicing o mutazioni che portano a proteine incomplete o non funzionali.
67
Qual è la differenza principale tra la gestione degli mRNA normali e quelli con mutazioni nonsense?
Gli mRNA normali hanno codoni di stop posizionati correttamente e vengono tradotti completamente. Gli mRNA con mutazioni nonsense hanno codoni di stop prematuri e sono distrutti dal NMD per prevenire la produzione di proteine difettose.
68
In quali casi il NMD non interviene anche se ci sono codoni di stop?
Il NMD non interviene se il codone di stop si trova dopo l'ultimo esone dell'mRNA. In questi casi, l'mRNA è considerato corretto, anche se contiene un codone di stop non previsto.
69
Come contribuisce il NMD alla qualità dell'mRNA?
Il NMD aiuta a mantenere la qualità dell'mRNA eliminando trascritti con errori di splicing o mutazioni che potrebbero produrre proteine non funzionali o dannose per la cellula.
70
Qual è un esempio pratico dell'uso dell'IRES nella ricerca scientifica?
L'IRES è usato per costruire vettori di espressione che includono reporter fluorescenti, come la GFP, per monitorare l'attività di geni e la traduzione di proteine in diverse condizioni cellulari o sperimentali.
71
Perché l'IRES è importante durante la mitosi?
Durante la mitosi, la traduzione basata sul CAP è inibita, ma l'IRES permette comunque la traduzione di proteine essenziali che sono necessarie per la divisione cellulare e altre funzioni mitotiche.
72
Come il NMD gestisce le anomalie dell'mRNA derivanti da errori di splicing?
Il NMD riconosce e distrugge mRNA che contiene segnali di errore derivanti da splicing improprio, prevenendo l'espressione di proteine che potrebbero risultare da trascritti incompleti o mal elaborati.
73
Qual è la funzione principale dell'RNA interference (iRNA) nei meccanismi cellulari?
L'RNA interference (iRNA) è un meccanismo di regolazione genica che riduce o silenzia l'espressione di geni specifici tramite degradazione dell'mRNA o inibizione della traduzione, utilizzando piccole molecole di RNA come miRNA e siRNA.
74
Quali sono i principali tipi di RNA coinvolti nell'RNA interference?
I principali tipi di RNA coinvolti sono i miRNA (microRNA) e i siRNA (small interfering RNA). I miRNA sono RNA non codificanti che regolano l'espressione genica attraverso appaiamenti imperfetti, mentre i siRNA derivano da RNA a doppio filamento e sono noti per la loro complementarità completa con l'mRNA target.
75
Che cosa scoprì Richard Jorgenson riguardo al fenomeno della co-soppressione?
Richard Jorgenson scoprì che cercando di over-esprimere un gene per il colore nei fiori, si ottenevano risultati inattesi di fiori bianchi o variegati a causa di un fenomeno chiamato co-soppressione, che è una forma di silenziamento genico post-trascrizionale (PTGS).
76
Quale fu la scoperta principale di Fire e Mello nel 1993 riguardo alla silenzianza genica nei vermi C. elegans?
Fire e Mello scoprirono che l'introduzione di RNA a doppio filamento in C. elegans portava alla degradazione dell'mRNA corrispondente e all'inattivazione del gene di interesse. Questo fenomeno, chiamato RNA interference (iRNA), si propagava alle generazioni successive e fu fondamentale per il riconoscimento del meccanismo.
77
Come funziona il complesso RISC nell'RNA interference?
Il complesso RISC (RNA-Induced Silencing Complex) contiene piccoli RNA come miRNA e siRNA associati alla proteina AGO2. Questo complesso riconosce e si lega all'mRNA target, inducendo il silenziamento genico attraverso la degradazione dell'mRNA o l'inibizione della traduzione.
78
Qual è la differenza tra miRNA e siRNA in termini di origine e funzione?
I miRNA (microRNA) derivano da pre-miRNA che formano strutture a stem-loop e regolano l'espressione genica attraverso appaiamenti parziali con l'mRNA target. I siRNA (small interfering RNA) derivano da RNA a doppio filamento e hanno una complementarità completa con il loro mRNA target, inducendo la sua degradazione.
79
Come viene generato un miRNA e quali sono le sue principali fasi di processamento?
Un miRNA viene inizialmente trascritto come parte di un pre-miRNA con una struttura a stem-loop. Questo pre-miRNA viene processato dal complesso Drosha/DGCR8 nel nucleo per formare un pre-miRNA a doppio filamento, che poi viene esportato nel citoplasma e ulteriormente processato da Dicer per generare il miRNA maturo a singolo filamento.
80
Che cosa sono i mirtroni e quale ruolo giocano nella biogenesi dei miRNA?
I mirtroni sono miRNA che si trovano all'interno degli introni e sono trascritti come parte di RNA primario con una struttura a stem-loop. Questi mirtroni vengono poi processati per formare miRNA maturo. Questo processo consente la produzione di miRNA a partire da sequenze introniche.
81
Come i miRNA regolano più mRNA diversi e qual è il concetto di 'complementarità imperfetta'?
I miRNA possono regolare più mRNA diversi grazie alla complementarità imperfetta tra il miRNA e l'mRNA target. Questo significa che i miRNA non devono essere perfettamente complementari all'intero mRNA target ma possono riconoscere e silenziare più mRNA attraverso regioni non completamente complementari, particolarmente nella zona 3' UTR dell'mRNA.
82
Qual è il ruolo della regione 3' UTR nell'interazione tra miRNA e mRNA?
La regione 3' UTR dell'mRNA è importante per l'interazione con i miRNA perché contiene le sequenze target per il miRNA. Una lunga 3' UTR fornisce ampio spazio per il legame del miRNA e per l'efficace silenziamento dell'espressione genica tramite il complesso RISC.
83
Come è stato scoperto il primo esempio di miRNA endogeno e quale gene è stato studiato?
Il primo esempio di miRNA endogeno è stato scoperto studiando il gene lin-4 in C. elegans. Lin-4 produce un miRNA di circa 22 nucleotidi che regola l'espressione del gene lin-14, dimostrando che i miRNA possono bloccare la traduzione di mRNA specifici all'interno della cellula.
84
Quali sono le principali applicazioni dell'RNA interference nella medicina e nella ricerca scientifica?
L'RNA interference è utilizzata per sviluppare terapie geniche, studiare il ruolo di geni specifici in malattie, progettare modelli cellulari per malattie genetiche e oncologiche, e creare farmaci. È anche impiegata per modulare l'espressione genica in esperimenti e per studi su risposte cellulari e meccanismi patogenetici.
85
Come i miRNA sono catalogati e studiati nella ricerca genica?
I miRNA sono catalogati in database specializzati che forniscono informazioni sulle loro sequenze, funzioni e target. Programmi bioinformatici e strumenti di sequenziamento sono utilizzati per identificare e predire nuovi miRNA, analizzare le loro interazioni con mRNA e comprendere il loro ruolo nella regolazione genica.
86
Qual è l'impatto dei miRNA sull'espressione della proteina p21 e quale esempio di miRNA regola la p21?
La proteina p21, che è coinvolta nel controllo del ciclo cellulare e nella risposta all'invecchiamento, è regolata da almeno 28 miRNA diversi. Questi miRNA influenzano l'espressione della p21 sia attivandola che disattivandola, dimostrando l'effetto combinatorio e complesso della regolazione da parte dei miRNA.
87
Quali sono i passaggi specifici nella prima fase della biogenesi dei miRNA?
Nella prima fase della biogenesi dei miRNA, un gene per miRNA è trascritto dalla RNA polimerasi II per formare un Pri-miRNA. Questo trascritto primario contiene una struttura a stem-loop, che è successivamente processata da Drosha (o DCGR8 nei mammiferi) in Pre-miRNA. Drosha riconosce il tratto ad anello e conserva la struttura stem-loop, aggiungendo un 5’P, 3’OH e un overhang di due nucleotidi al 3’.
88
Qual è la funzione specifica di Drosha e DCGR8 nella biogenesi dei miRNA?
Drosha e DCGR8 sono endonucleasi che riconoscono e tagliano il Pri-miRNA per formare il Pre-miRNA. Drosha agisce nel nucleo, mentre DCGR8 collabora con Drosha in mammiferi. Questi enzimi rimuovono il loop dell'anello e formano il Pre-miRNA con una sporgenza di due nucleotidi al 3’.
89
Come avviene il trasporto del Pre-miRNA al citoplasma e qual è il ruolo dell'Esportina 5?
Il Pre-miRNA viene trasportato dal nucleo al citoplasma grazie all'Esportina 5, una proteina che riconosce e lega il Pre-miRNA e medica il suo passaggio attraverso il poro nucleare. L'Esportina 5 funziona in collaborazione con RanGTP per facilitare il trasporto.
90
Qual è il ruolo specifico di DICER nella fase di processamento del miRNA nel citoplasma?
DICER, in associazione con il cofattore TRBP, processa il Pre-miRNA nel citoplasma, rimuovendo il loop e generando piccoli frammenti di RNA a doppio filamento (miRNA duplex). DICER taglia l'RNA in pezzi di circa 20-25 nucleotidi di lunghezza, preparando i miRNA per l'inclusione nel complesso RISC.
91
Che cosa avviene dopo la formazione dei piccoli segmenti di miRNA e come si lega AGO2 al miRNA?
Dopo la formazione dei piccoli segmenti di miRNA, uno dei due filamenti del duplex viene selezionato come filamento guida (guide RNA strand) e viene incorporato nel complesso RISC insieme alla proteina AGO2. AGO2 è responsabile della selezione e del rilascio del filamento guida, mentre l'altro filamento viene degradato.
92
Come si differenzia l'azione dei miRNA dal processo di mRNA cleavage mediato dai siRNA?
I miRNA, quando si appaiono in modo imperfetto con il loro mRNA target, portano principalmente a una repressione della traduzione e talvolta alla degradazione dell'mRNA. Invece, i siRNA si legano in modo altamente specifico e perfetto all'mRNA target, portando alla sua degradazione (cleavage) senza influenzare il gene stesso.
93
Qual è il significato della 'high stringency' nei siRNA rispetto ai miRNA?
La 'high stringency' nei siRNA si riferisce al loro appaiamento preciso e completo con l'mRNA target, che porta alla degradazione diretta dell'mRNA. Al contrario, i miRNA operano con una complementarità imperfetta, influenzando la traduzione e talvolta la stabilità dell'mRNA senza una degradazione completa.
94
Che cosa sono i mirtroni e come si formano rispetto ai miRNA canonici?
I mirtroni sono una classe di miRNA non canonici che derivano dagli introni. Essi sono processati come pri-miRNA, ma provengono da una struttura intronica con esoni. Dopo lo splicing, il lariat dell'introne viene staccato e processato in modo simile ai pri-miRNA, formando il mirtron maturo che interagisce con RISC.
95
Quali sono le differenze specifiche tra i miRISC e l'activated RISC in termini di meccanismo di azione?
miRISC è un complesso che può causare degradazione dell'mRNA tramite esonucleasi come CCR4 e CAF1, che agiscono sulla coda del poli-A. Activated RISC, invece, può bloccare la traduzione dell'mRNA target senza degradarlo, agendo tramite un'interazione imperfetta con il miRNA.
96
Quali sono i nove meccanismi di inibizione che RISC può utilizzare per influenzare l'espressione genica?
I nove meccanismi di inibizione da parte di RISC includono: 1) degradazione dell'mRNA; 2) repressione della traduzione; 3) inibizione della trascrizione; 4) aumento della stabilità dell'mRNA; 5) competizione per il legame a fattori di trascrizione; 6) alterazione dell'accesso al sito di traduzione; 7) blocco del legame di proteine di traduzione; 8) regolazione negativa di trascrittori; 9) regolazione della disponibilità di mRNA per il legame ai ribosomi.
97
Come i miRNA contribuiscono al mantenimento della stemness nelle cellule staminali?
I miRNA regolano il mantenimento della stemness nelle cellule staminali controllando l'espressione di fattori di trascrizione e proteine che sono cruciali per la pluripotenza e la capacità di auto-rinnovamento. Regolano anche il bilanciamento tra la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali.
98
Qual è l'effetto fenotipico della delezione di un singolo miRNA rispetto alla sua famiglia?
La delezione di un singolo miRNA di una famiglia generalmente ha un effetto fenotipico minimo a causa della ridondanza funzionale. Tuttavia, la delezione simultanea di tutti i miRNA di una stessa famiglia può avere effetti più marcati, dimostrando l'importanza della completa famiglia di miRNA per la regolazione fenotipica.
99
Quali sono le conseguenze della mancanza di miRNA nella regolazione dei trasposoni?
La mancanza di miRNA può portare a una mobilità eccessiva dei trasposoni, che può causare instabilità genetica e problemi nella segregazione cromosomica. I miRNA sopprimono la mobilità dei trasposoni per prevenire la loro dispersione e l'integrazione in regioni geniche critiche.
100
Che cosa sono i ceRNAs e quale ruolo svolgono nella regolazione genica?
I ceRNAs (competing endogenous RNAs) sono RNA che competono con i mRNA per il legame con i miRNA. Funzionano come 'spugne', legandosi ai miRNA e impedendo loro di regolare i loro target mRNA. Questo può portare alla sovraespressione dei geni target dei miRNA che sono legati ai ceRNAs.
101
Come i ceRNAs influenzano la regolazione dei miRNA e dei geni target?
I ceRNAs attraggono i miRNA attraverso legami di complementarità, riducendo la quantità di miRNA disponibile per interagire con altri mRNA. Questo può sollevare la repressione sui geni target dei miRNA, permettendo la loro espressione e codifica.
102
Che cosa sono gli RNA circolari e come si formano?
Gli RNA circolari sono una classe di RNA che si formano quando l'estremità 3’ di un esone si unisce all'estremità 5’ di un altro esone, creando una struttura ad anello anziché una linea retta. Questo avviene tramite uno splicing alternativo che connette le estremità lontane tra loro.
103
Qual è la differenza principale tra RNA circolari e RNA lineari?
Gli RNA circolari differiscono dagli RNA lineari per la loro struttura a forma di anello, risultante dall'unione delle estremità 3’ e 5’ di esoni diversi. Questa struttura li rende meno suscettibili alla degradazione da parte delle esonucleasi, rispetto agli RNA lineari.
104
In che modo gli RNA circolari possono influenzare la regolazione dei miRNA?
Alcuni RNA circolari funzionano come ceRNAs, assorbendo i miRNA in eccesso e prevenendo che essi regolino i loro target mRNA. Per esempio, nei neuroni, gli RNA circolari possono legarsi ai miR-7, permettendo la produzione di proteine che altrimenti sarebbero bloccate dai miR-7.
105
Qual è il ruolo del Ribosome Profiling nella differenziazione tra trascrittoma e proteoma?
Il Ribosome Profiling permette di identificare quali mRNA sono effettivamente tradotti in proteine. Questo metodo consiste nel purificare l’mRNA legato ai ribosomi, rimuovere l'RNA in eccesso, e sequenziare i frammenti di RNA bloccati dai ribosomi, fornendo una visione della traduzione reale e del turnover proteico.
106
Come il Ribosome Profiling contribuisce a capire la quantità di proteina prodotta da un gene?
Il Ribosome Profiling consente di determinare la quantità di mRNA che è attivamente tradotto in proteina in un momento dato, offrendo informazioni su quali mRNA sono legati ai ribosomi e quanto spesso vengono tradotti, quindi differente dalla semplice misurazione del trascrittoma.
107
Quali sono i passaggi fondamentali nel processo di Ribosome Profiling?
1. Purificazione dell’mRNA legato ai ribosomi. 2. Rimozione dell'RNA in eccesso tramite nucleasi. 3. Sequenziamento dei frammenti di RNA protetti dai ribosomi, utilizzando il footprinting per allineare questi frammenti sulla sequenza del genoma e identificare la traduzione dei geni.
108
Che cosa si intende per turnover proteico e perché è importante?
Il turnover proteico si riferisce alla vita utile di una proteina dalla sua sintesi fino alla sua degradazione. È importante perché influenza la quantità e la disponibilità delle proteine nella cellula, fornendo informazioni su come le proteine vengono regolate e mantenute nel tempo.
109
Quali sono le tecniche di laboratorio utilizzate per studiare l’effetto dei miRNA sulla traduzione delle proteine?
1. Loss-of-function study: utilizza iRNA per silenziare la produzione di una proteina. 2. In vitro transcription: produce RNA chimicamente. 3. Antagomeri/anti-miR/blockmir: piccoli oligonucleotidi progettati per inibire i miRNA e ripristinare la traduzione dell’mRNA target.
110
Come possono essere utilizzati i miRNA e i ceRNAs nella terapia genica?
I miRNA e i ceRNAs possono essere utilizzati per regolare l'espressione genica attraverso l'uso di antagomeri per silenziare miRNA specifici, o inserendo ceRNAs per alterare l'equilibrio miRNA e promuovere l'espressione genica desiderata. Alcune malattie genetiche possono essere trattate con queste tecniche per correggere la disregolazione genica.
111
Quali sono i metodi per creare un fenocopia della mutazione tramite miRNA?
Per creare una fenocopia della mutazione, si può introdurre un miRNA specifico nella cellula che blocca la traduzione del gene target, imitando gli effetti di una mutazione genetica senza alterare il gene stesso. Questo può essere fatto sintetizzando nuovi miRNA o modificando quelli esistenti per mirare a specifici messaggeri.
