Lezione 4 Flashcards

1
Q

Cos’è la replicazione del DNA?

A

La replicazione del DNA è un processo biologico in cui una molecola di DNA crea una copia identica di sé stessa, ed è alla base dell’ereditarietà biologica.

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2
Q

Qual è l’enzima principale coinvolto nella replicazione del DNA?

A

L’enzima principale coinvolto nella replicazione del DNA è la DNA polimerasi.

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3
Q

Qual è la reazione complessiva del processo di replicazione del DNA?

A

La reazione complessiva è: (dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + Ppi, dove l’aggiunta di un deossinucleotide allunga la catena di DNA di un nucleotide e rilascia un pirofosfato.

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4
Q

Quali sono i tre modelli di replicazione del DNA?

A

I tre modelli di replicazione sono: semiconservativo, conservativo e dispersivo.

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5
Q

In cosa consiste il modello semiconservativo di replicazione del DNA?

A

Nel modello semiconservativo, ogni molecola di DNA figlia è formata da un filamento parentale e da un filamento di nuova sintesi.

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6
Q

Come funziona il modello conservativo di replicazione del DNA?

A

Nel modello conservativo, si crea una molecola di DNA identica a quella parentale con i due filamenti originali, mentre l’altra molecola è completamente di nuova sintesi.

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7
Q

Cosa caratterizza il modello dispersivo di replicazione del DNA?

A

Nel modello dispersivo, entrambe le molecole figlie contengono sequenze sia parentali che di nuova sintesi, mescolate tra loro.

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8
Q

Quale esperimento ha dimostrato il modello corretto di replicazione del DNA?

A

L’esperimento di Meselson e Stahl ha dimostrato che il modello corretto di replicazione del DNA è quello semiconservativo.

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9
Q

Cosa succede al DNA dopo la prima replicazione nell’esperimento di Meselson e Stahl?

A

Dopo la prima replicazione, si ottiene DNA con densità intermedia, escludendo il modello conservativo.

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10
Q

Come si conferma il modello semiconservativo nell’esperimento di Meselson e Stahl?

A

Dopo la seconda replicazione, metà delle molecole hanno densità intermedia e l’altra metà densità leggera, confermando il modello semiconservativo.

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11
Q

Come avviene la sintesi dei nuovi filamenti di DNA secondo il modello semiconservativo?

A

La sintesi avviene in entrambe le direzioni a partire dall’apertura dei filamenti parentali, seguendo l’appaiamento delle basi complementari.

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12
Q

Cosa sono le ‘forcelle di replicazione’?

A

Le forcelle di replicazione sono strutture a forma di Y che si formano quando i due filamenti di DNA vengono separati durante la replicazione.

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13
Q

Quali sono le conseguenze di errori nel processo di replicazione del DNA?

A

Errori nella replicazione del DNA possono portare a gravi conseguenze per la cellula, come nel caso del cancro, dove mutazioni nei geni oncogeni causano la malattia.

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14
Q

Che cos’è il modello θ replication e in quale contesto viene utilizzato?

A

Il modello θ replication è il processo di replicazione del DNA nei procarioti, descritto per la prima volta nel batterio Escherichia coli, e prende il nome dalla somiglianza della struttura del DNA durante la replicazione alla lettera greca θ.

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15
Q

Qual è il ruolo dell’origine di replicazione nei procarioti e come viene riconosciuta?

A

L’origine di replicazione è una sequenza specifica del DNA dove inizia la replicazione, ed è riconosciuta da proteine specifiche che avviano il processo.

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16
Q

Come e quando si conclude la replicazione del DNA circolare nei procarioti?

A

La replicazione del DNA circolare nei procarioti si conclude quando le due forche replicative si incontrano, formando una struttura a forma di θ, e successivamente i due filamenti si separano, dando origine a due molecole figlie identiche.

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17
Q

Quali sono le differenze tra la replicazione del DNA nei procarioti e negli eucarioti in termini di velocità e durata del processo?

A

Nei procarioti, la replicazione del DNA avviene a una velocità di circa 1000 nucleotidi al secondo e si completa in circa un’ora, mentre negli eucarioti il processo è più lento e complesso.

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18
Q

Cosa sono le Single Strand Binding Proteins (SSBP) e qual è il loro ruolo specifico durante la replicazione del DNA nei procarioti?

A

Le SSBP sono proteine che si legano ai filamenti di DNA singolo per mantenerli separati durante la replicazione, impedendo che si riappaiino prima che la sintesi dei nuovi filamenti sia completata.

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19
Q

Quali sono le tre fasi del processo di replicazione del DNA?

A

Le tre fasi del processo di replicazione del DNA sono: Iniziazione, Elongazione e Terminazione.

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20
Q

Cosa avviene durante la fase di iniziazione della replicazione del DNA?

A

Durante la fase di iniziazione, si riconoscono le sequenze di origine, si apre la doppia elica, si forma la bolla di replicazione e le forcelle di replicazione vengono create.

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21
Q

Come avviene l’elongazione durante la replicazione del DNA?

A

Durante l’elongazione, la DNA polimerasi sintetizza il DNA. Il filamento leading viene sintetizzato continuamente, mentre il filamento lagging viene sintetizzato in frammenti discontinui chiamati frammenti di Okazaki, utilizzando primer.

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22
Q

Cosa accade durante la fase di terminazione della replicazione del DNA?

A

Durante la terminazione, la replicazione viene completata e si formano due molecole figlie identiche.

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23
Q

Perché la direzione di polimerizzazione del DNA è sempre 5’→3’ e come influisce sui filamenti lagging e leading?

A

La direzione di polimerizzazione è 5’→3’ perché la DNA polimerasi aggiunge nucleotidi solo al 3’ del nucleotide preesistente. Questo causa una sintesi continua del leading strand e una sintesi discontinua del lagging strand in frammenti di Okazaki.

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24
Q

Qual è il ruolo degli enzimi RNAasi H, DNA Pol-I e DNA Ligasi nella fase finale della replicazione?

A

RNAasi H rimuove i primer a RNA dal DNA, DNA Pol-I riempie gli spazi lasciati dai primer con DNA e DNA Ligasi unisce i frammenti di DNA per completare il filamento continuo.

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25
Q

Qual è la principale differenza tra la replicazione del DNA nei procarioti e negli eucarioti riguardo al ciclo cellulare?

A

Negli eucarioti, la replicazione del DNA è strettamente collegata al ciclo cellulare, mentre nei procarioti la replicazione può avvenire indipendentemente dalla crescita cellulare.

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26
Q

Come viene ottimizzata la velocità di replicazione del DNA negli eucarioti?

A

La velocità di replicazione è ottimizzata attraverso la parallelizzazione, dove più bolle di replicazione si aprono simultaneamente per sintetizzare i filamenti di DNA in vari punti.

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27
Q

Quali enzimi specifici sono coinvolti nella replicazione del DNA negli eucarioti e quali sono i loro ruoli?

A

Negli eucarioti, la DNA-Pol-α sintetizza il primer, la DNA-Pol-δ svolge la polimerizzazione sul filamento lagging, e la DNA-Pol-ε si occupa della sintesi del filamento leading. La DNA Pol-γ è specifica per la sintesi del DNA mitocondriale.

28
Q

Qual è una differenza chiave nel termine della sintesi del DNA tra procarioti ed eucarioti?

A

Nei procarioti, la replicazione termina quando le due forcelle replicative si ricompongono, mentre negli eucarioti il processo termina in corrispondenza di specifiche sequenze chiamate Termination Sites.

29
Q

Cos’è la Polymerase Chain Reaction (PCR) e chi l’ha ideata?

A

La PCR è una tecnica che permette di amplificare una sequenza specifica di DNA partendo da campioni di DNA genomico, emulando i meccanismi della replicazione cellulare. È stata ideata da Kary Mullis, che ha ricevuto il premio Nobel per la chimica nel 1993.

30
Q

Quali sono gli elementi necessari per eseguire una PCR?

A

Gli elementi necessari per la PCR sono:
1. Una DNA polimerasi batterica termostabile, come la Taq-pol, che catalizza la polimerizzazione e resiste alle alte temperature della macchina PCR.

  1. Due primers, uno per ciascun filamento di DNA, che ibridano alle regioni complementari e sono chimicamente progettati per identificare una specifica regione target.
  2. Una macchina PCR (termo ciclatore) che varia la temperatura ciclicamente.
  3. Nucleotidi liberi per l’assemblaggio.
31
Q

Quali sono le tre fasi principali di un ciclo di PCR e cosa avviene in ciascuna?

A

Le tre fasi principali di un ciclo di PCR sono:
1. Denaturazione: I filamenti di DNA vengono separati tramite riscaldamento a 95°C.

  1. Annealing: La temperatura viene abbassata a circa 60°C per permettere l’ibridazione dei primers alle regioni complementari del DNA denaturato.
  2. Elongation: La DNA polimerasi aggiunge nucleotidi al DNA in crescita.
32
Q

Cosa si intende per amplificazione esponenziale nella PCR e quali sono i risultati tipici dopo 30 cicli?

A

L’amplificazione esponenziale nella PCR significa che il numero di copie della sequenza target aumenta in modo esponenziale con ogni ciclo. Dopo 30 cicli, si ottengono circa un miliardo di copie della sequenza target.

33
Q

Come viene utilizzata la PCR per rilevare la presenza di virus?

A

La PCR amplifica le tracce di genoma virale presenti in quantità ridotte nei campioni, come nella mucosa nasale. Utilizzando primers specifici e coloranti fluorescenti, è possibile rilevare la presenza del virus grazie all’aumento della fluorescenza che indica la presenza della sequenza target.

34
Q

Qual è il ruolo dei plasmidi nei batteri e come sono utilizzati nel clonaggio?

A

I plasmidi sono piccole molecole di DNA nei batteri che replicano indipendentemente dal DNA genomico. Sono usati nel clonaggio perché possono essere facilmente purificati, introdotti in batteri e amplificati. I plasmidi possono anche conferire vantaggi come la resistenza agli antibiotici.

35
Q

Come funzionano gli enzimi di restrizione nel clonaggio?

A

Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA in sequenze specifiche chiamate siti di restrizione. Questi enzimi possono generare estremità blunt (piatte) o sticky (coesive) che consentono l’inserimento di frammenti di DNA in plasmidi linearizzati. Le estremità compatibili facilitano la ricombinazione del DNA.

36
Q

Cosa è una libreria di plasmidi e come viene utilizzata?

A

Una libreria di plasmidi è una collezione di plasmidi contenenti frammenti diversi di DNA. Ogni plasmide porta un frammento unico. Quando una libreria viene introdotta nei batteri, ogni colonia porta un plasmide specifico. Le tecniche di screening permettono di isolare e far crescere i batteri con il plasmide di interesse.

37
Q

Qual è la differenza principale tra PCR e clonaggio in termini di dimensioni dei frammenti amplificabili?

A

La PCR è limitata all’amplificazione di frammenti fino a circa 1 kb, mentre il clonaggio può amplificare frammenti molto più grandi, fino a circa 20 kb.

38
Q

Come viene utilizzata la trascrittasi inversa nei plasmidi e quale tipo di DNA viene prodotto?

A

La trascrittasi inversa è un enzima retrovirale che sintetizza DNA a partire da RNA, creando DNA complementare (cDNA). Questo cDNA può essere clonato all’interno di plasmidi per studi ulteriori.

39
Q

Quale funzione svolge l’elicasi durante la replicazione del DNA nei procarioti, e come influisce sulla struttura del DNA?

A

L’elicasi separa i due filamenti della doppia elica di DNA e permette la formazione della bolla di replicazione, essenziale per il proseguimento della replicazione in entrambe le direzioni.

40
Q

In che modo la DNA polimerasi contribuisce al processo di replicazione nei procarioti, e quale funzione aggiuntiva svolge per garantire la fedeltà della replicazione?

A

La DNA polimerasi catalizza l’aggiunta successiva di nucleotidi durante la replicazione e svolge un’importante funzione di proofreading, correggendo eventuali errori di appaiamento tra nucleotidi.

41
Q

Qual è la funzione della DNA girasi (topoisomerasi) durante la replicazione del DNA nei procarioti, e perché è essenziale?

A

La DNA girasi rilascia le torsioni accumulate nel DNA a doppio filamento durante la replicazione, evitando la formazione di superavvolgimenti che potrebbero interferire con il processo.

42
Q

Come avviene la sintesi dei frammenti di Okazaki nel filamento lagging durante la replicazione del DNA nei procarioti, e quale enzima è responsabile della loro unione?

A

Nel filamento lagging, la replicazione avviene in frammenti discontinui chiamati frammenti di Okazaki, che vengono successivamente uniti dalla DNA ligasi, eliminando le interruzioni di legame tra i nucleotidi.

43
Q

Quali sono le funzioni principali della DNA Pol-I nei procarioti, e come contribuisce alla precisione del processo di replicazione?

A

La DNA Pol-I è responsabile del proofreading, correggendo gli errori di appaiamento, e del gap-filling, riempiendo gli spazi tra i segmenti di DNA, assicurando la precisione della replicazione.

44
Q

Quali sono le funzioni specifiche dei tre siti strutturali della DNA Pol-I, noti come palmo, dita e pollice, nella replicazione del DNA?

A

Il palmo contiene il sito attivo per la degradazione e sintesi del DNA, le dita avvicinano i nucleotidi al sito attivo e orientano i filamenti, mentre il pollice alloggia il DNA all’interno dell’enzima durante la replicazione.

45
Q

In quali circostanze entra in gioco la DNA Pol-II nei procarioti, e quale funzione svolge rispetto alla DNA Pol-I e DNA Pol-III?

A

La DNA Pol-II entra in gioco principalmente nei processi di riparazione del DNA, particolarmente quando la DNA Pol-I e la DNA Pol-III non sono funzionanti, agendo come un enzima accessorio.

46
Q

Quali caratteristiche distinguono la DNA Pol-III dagli altri tipi di DNA polimerasi nei procarioti, e quale ruolo fondamentale svolge nella replicazione?

A

La DNA Pol-III ha la più alta attività di polimerizzazione ed è responsabile dell’allungamento dei nuovi filamenti di DNA durante la replicazione, operando in modo efficiente e rapido.

47
Q

Come avviene l’inizio della polimerizzazione del DNA durante la replicazione nei procarioti, e quale ruolo svolge il primer a RNA?

A

La polimerizzazione inizia con un primer a RNA, che fornisce il punto di partenza per la DNA polimerasi, la quale aggiunge i nucleotidi successivi per formare il nuovo filamento di DNA.

48
Q

Qual è la struttura e la funzione del frammento di Klenow nella DNA Pol-I, e come contribuisce al proofreading?

A

Il frammento di Klenow, parte maggiore della DNA Pol-I, è responsabile dell’attività esonucleasica 3’→5’, essenziale per la correzione degli errori durante la replicazione, assicurando la precisione del processo.

49
Q

Cos’è il sequenziamento di prima generazione?

A

Il sequenziamento di prima generazione, noto anche come metodo Sanger, è utilizzato per verificare che la sequenza di interesse sia esattamente quella selezionata.

50
Q

Come funziona il sequenziamento di prima generazione (Sanger)?

A

Nel sequenziamento Sanger si utilizza la tecnica PCR aggiungendo didesossiribonucleotidi trifosfato (ddNTPs) fluorescenti, che bloccano la sintesi del DNA in punti casuali. I frammenti vengono poi separati tramite elettroforesi per determinare la sequenza nucleotidica.

51
Q

Cosa avviene durante la fase di preparazione del campione nel NGS?

A

Durante la preparazione del campione, il DNA sorgente viene estratto, frammentato e legato a sequenze adattatrici (adapters). Successivamente, il DNA viene amplificato e sottoposto a controllo di qualità.

52
Q

Quali piattaforme sono utilizzate nel Next Generation Sequencing?

A

Le piattaforme utilizzate nel NGS includono Roche, Illumina (la più utilizzata in ambito diagnostico) e Ion Torrent.

53
Q

Cos’è l’Emulsion PCR e come viene utilizzata nel NGS?

A

L’Emulsion PCR è un metodo di amplificazione utilizzato nel NGS, in cui il DNA frammentato viene inserito in goccioline oleose insieme a BEADS e primers. All’interno di ogni gocciolina, si amplifica un singolo frammento di DNA legato a una BEAD, garantendo che ogni BEAD contenga solo frammenti dello stesso tipo.

54
Q

Cos’è il Polony PCR?

A

Il Polony PCR è un metodo di amplificazione utilizzato nel sequenziamento genetico, dove i frammenti di dna, con gli adapters legati, vengono denaturati e ancorati su un chip, dove avviene la bridge amplification.

55
Q

Come funziona il Polony PCR?

A

Nel Polony PCR, i frammenti di dna vengono legati a una piastra metallica (chip) tramite oligonucleotidi complementari agli adapters. Si forma una struttura ‘a ponte’, e tramite amplificazioni cicliche, si creano cluster di frammenti identici.

56
Q

Cos’è la bridge amplification?

A

La bridge amplification è un processo in cui un frammento di dna ancorato a una slide si piega, formando una struttura ‘a ponte’, e viene sintetizzato un nuovo filamento. Questo processo viene ripetuto ciclicamente, formando cluster di frammenti.

57
Q

Cos’è la Cluster amplification?

A

La Cluster amplification è il risultato della ripetizione ciclica della bridge amplification nel Polony PCR, creando gruppi di frammenti identici sulla piastra solida.

58
Q

Qual è la differenza tra Ion Torrent e Illumina in termini di sequenziamento?

A

Ion Torrent utilizza Emulsion PCR per l’amplificazione e rileva variazioni di pH durante il sequenziamento. Illumina utilizza Polony PCR e si basa sulla tecnologia Sequencing by Synthesis (SBS) con nucleotidi marcati da fluorofori.

59
Q

Come funziona il sequenziamento con Illumina?

A

Illumina utilizza nucleotidi fluoroforati che si legano ai primers su un chip. La sequenza viene letta rilevando l’intensità di fluorescenza per ciascun nucleotide e il risultato viene esportato in un file di testo.

60
Q

Qual è la funzione della fase di analisi bioinformatica nel sequenziamento?

A

La fase di analisi bioinformatica allinea il genoma appena sequenziato con filamenti di riferimento, identificando eventuali analogie o sequenze ripetute.

61
Q

Cos’è il Third Generation Sequencing?

A

Il Third Generation Sequencing è una tecnica che permette di ottenere frammenti di DNA molto lunghi, superiori a mille paia di basi, senza l’utilizzo della PCR.

62
Q

Quali sono le due principali piattaforme di Third Generation Sequencing?

A

Le due principali piattaforme sono Pacific bioscience e Oxford nanopore.

63
Q

Come funziona il sequenziamento con Pacific bioscience?

A

Pacific bioscience utilizza una preparazione della libreria basata sull’aggiunta di adapters e sequenze a forma di hairpin, insieme a una tecnologia chiamata SMRT (Single Molecule Real Time). Un primer si ibrida alla sequenza hairpin e viene aggiunta una polimerasi per il sequenziamento.

64
Q

Quali sono le particolarità della piattaforma Oxford nanopore?

A

Oxford nanopore è caratterizzata da un sequenziatore molto piccolo e dalla capacità di leggere sequenze di DNA molto lunghe, fino a diverse migliaia di paia di basi.

65
Q

Come avviene il sequenziamento con Oxford nanopore?

A

Oxford nanopore non utilizza fluorofori. La sequenza viene letta grazie a pori biologici contenenti una molecola adapter. Un sensore elettronico rileva il cambiamento di corrente ionica causato dal passaggio del DNA attraverso il poro, permettendo di identificare le basi del DNA.