Labo 6 Théorie : isolement de l'ADN plasmidique. Flashcards
Préparation de l’ADN plasmidique : Dans le labo 6, l’ADN plasmidique est purifié à partir de quoi?
Des bactéries en croissance dans un milieu liquide contenant un antibiotique.
Préparation de l’ADN plasmidique : Les plasmides pUC, pGEM et pBluescript sont couramment utilisés et sont présents en un si grand nombre de copies par cellule qu’il est possible d’obtenir combien d’ADN plasmidique par ml de culture bactérienne?
Entre 2 à 5µg d’ADN plasmidique/ml de culture.
Préparation de l’ADN plasmidique : Comment appelle-t-on les méthodes de minipréparation de plasmides?
“minipreps”
Préparation de l’ADN plasmidique : Dans les minipreps, quelle est la première étape?
Un volume de 1 à 1.5 ml d’une culture de bactéries en phase stationnaire sont transféré dans un microtube et les bactéries sont recueillies par centrifugation.
Préparation de l’ADN plasmidique : Dans les minipreps, après avoir recueillies les bactéries par centrifugation, quoi faire? (ceci est une étape optionnelle)
Les bactéries peuvent être traitées avec le lysozyme pour digérer la paroi cellulaire (optionnel).
Préparation de l’ADN plasmidique : Lors des minipreps, après avoir recueilli les bactéries par centrifugation et après avoir digéré la paroi cellulaire, que doit-on faire?
Les bactéries sont brisées soit par un traitement alcalin ou par ébullition.
Préparation de l’ADN plasmidique : Lors des minipreps, après avoir recueilli les bactéries par centrifugation et les briser par un traitement alcalin ou par ébullition, que doit-on faire?
Une centrifugation est nécessaire pour séparer l’ADN chromosomique (culot) et l’ADN plasmidique (surnageant).
Préparation de l’ADN plasmidique : Lors des minipreps, après avoir recueilli les bactéries par centrifugation, après les avoir brisé par un traitement alcalin ou par ébullition et après avoir centrifuger pour séparer l’ADN chromosomique de l’ADN plasmidique, que doit-on faire?
La déprotéinisation et un traitement à la RNase sont effectués avant de précipiter l’ADN.
Préparation de l’ADN plasmidique : Quelle est la méthode de miniprep qui est utilisé lors de ce laboratoire?
C’est une méthode de minipréparation de plasmides visant le bris des cellules par ébullition et la purification de l’ADN par précipitation avec le CTAB.
Préparation de l’ADN plasmidique : Quels sont les avantages de la méthode de miniprep de plasmides utilisée lors du laboratoire?
- Rapide
- N’implique par l’utilisation du mélange de phénol-chloroforme pour la déprotéinisation
- Fournit une préparation d’ADN plasmidique suffisamment pure pour la plupart des besoins en recherche.
Cartographie des sites de restriction : Que doit-on faire pour permettre l’établissement de la carte d’un fragment d’ADN?
- Une digestion de l’ADN par les endonucléases de restriction
- Une analyse électrophorétique des fragments.
Cartographie des sites de restriction : Comment peut-on trouver le nombre et l’ordre des sites de restriction d’un ADN?
En faisant agir une ou plusieurs enzymes de restriction sur un fragment d’ADN.
Cartographie des sites de restriction : Pour faire la cartographie quelle est la première étape que les chercheurs font? Les chercheurs sélectionnent d’abord quoi?
Ils sélectionnent les enzymes les moins chères qui coupent dans une séquence de 4 ou 6 paires de bases.
Cartographie des sites de restriction : Pour déterminer la localisation du site de restriction, qu’est ce qu’il est nécessaire de faire?
Une digestion avec 2 enzymes :
- une qui coupe dans le fragment
- l’autre qui coupe uniquement dans le SMC (ex : EcoR1 ou Kpn1).
Cartographie des sites de restriction : Si on a 2 sites de coupure pour une enzyme, un dans le fragment et l’autre dans le SMC, ça veux dire quoi?
Qu’on peut immédiatement positionner le site dans le fragment.
Ceci est évidemment la situation la plus simple car on pourrait retrouver plus d’un site de coupure à l’intérieur du fragment cloné.
