Labo 2 théorie : préparation d'ADN 2

Question 1

Extraction de l’ADN cellulaire : Quand est-il nécessaire de briser les cellules avant de procéder à l’extraction de l’ADN?

Answer 1

Quand on fait affaire à des cellules végétales et de certains champignons qui ont entourées d’une paroi cellulaire.

Question 2

Extraction de l’ADN cellulaire : Avec quoi est ce que la paroi cellule des levures est-elle digérée?

Answer 2

C’est avec l’enzyme lyticase (c’est une zymolyase).

Question 3

Extraction de l’ADN cellulaire : La lyticase est isolée de quoi dans la nature?

Answer 3

D’un actinomycète.

Question 4

Extraction de l’ADN cellulaire : Qu’est ce que possède la lyticase?

Answer 4

De l’Endo ß-1,3 glucanase;
Des protéases.

Les deux hydrolysent la paroi cellulaire de la levure.

Question 5

Extraction de l’ADN cellulaire : Les méthodes d’extraction des acides nucléiques sont classés en 3 principales classes. Selon quoi sont-elles classées?

Answer 5

Selon le principe auquel elles font appel.

Question 6

Extraction de l’ADN cellulaire : Quelles sont les 3 classes de méthodes d’extraction des acides nucléiques?

Answer 6

1. Méthodes utilisant des solvants non organiques (ex. sels)
2. Méthodes utilisant des solvants organiques (ex. phénol-chloroforme)
3. Méthodes basées sur l’utilisation de microcolonnes de résines échangeurs d’ions (ex. produits commerciaux).

Question 7

Extraction de l’ADN cellulaire : Les méthodes d’extraction et de purification des acides nucléiques sont basées sur quoi?

Answer 7

Sur la propriété qu’ont les particules de silice d’adsorber sélectivement les acides nucléiques.

Question 8

Extraction de l’ADN cellulaire : Les solutions de lavage permettent de faire quoi?

Answer 8

De se débarrasser des contaminants tels que l’hémoglobine, les protéines plasmiques ou les ions Fe2+.

Question 9

Extraction de l’ADN cellulaire : Quelle est l’autre méthode de purification des acides nucléiques pour les quantités industrielles?

Answer 9

C’est de centrifuger l’homogénat en gradient de densité.

Question 10

Extraction de l’ADN cellulaire : En quoi consiste la centrifugation de l’homogénat en gradient de densité?

Answer 10

C’est quand on centrifuge à haute vitesse l’échantillon brut dans une éprouvelle contenant un gradient de densité formé par une solution de CsCl. Lors de la centrifugation, les macromolécules présentent dans la solution de CsCl forment des bandes distinctes selon leur densité.

Question 11

Extraction de l’ADN cellulaire : En présence de quoi est ce que la protéinase K digère les cellules quand on veut préparer l’ADN entier de la levure?

Answer 11

Ça se fait en présence d’EDTA et d’un détergeant tel que les SDS suivi d’une déprotonisation utilisant une solution saline.

Question 12

Extraction de l’ADN cellulaire : Chez la levure, suite à la préparation de l’ADN total par une digestion des cellules, l’ARN contaminant est éliminé comment?

Answer 12

Par une digestion avec l’enzyme RNase.

Question 13

Extraction de l’ADN cellulaire : Chez la levure, suite à la préparation de l’ADN total par une digestion des cellules, et suite à l’élimination de l’ARN contaminant, que doit-on faire avec l’ADN?

Answer 13

On le précipite avec l’alcool éthylique ou de l’isopropanol.

Question 14

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Avec quoi est ce que l’on peut déterminer la pureté et la concentration de l’ADN dans une solution?

Answer 14

À l’aide de la spectrophotométrie.

Question 15

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Lors de la spectrophotométrie, l’absorbance de la solution à une longueur d’onde de 260 nm nous indique quoi?

Answer 15

La présence d’acides nucléiques dont l’ADN.

Question 16

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Lors de la spectrophotométrie, l’absorbance à 280 nm nous révèle quoi?

Answer 16

La présence de protéines.

Question 17

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Quel est le rapport que l’on doit faire pour nous indiquer s’il y a présence de protéines?

Answer 17

C’est le rapport entre les lectures obtenues à 260 nm et à 280 nm.

Question 18

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Le rapport 260/280 devrait être supérieur à quoi?

Answer 18

1,75.

Question 19

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Si le rapport260/280 est plus faible que 1,75 , ça indique la présence de quoi?

Answer 19

De protéines.

Question 20

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Que ce passe-t-il s’il y a des protéines dans la solution d’ADN?

Answer 20

Il va falloir refaire à nouveau l’extraction des acides nucléiques.

Question 21

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Si le rapport 260/280 est autour de 2,0 , ça nous indique quoi?

Answer 21

Qu’il y a contamination par l’ARN (qui absorbe aussi à 260nm.

Question 22

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : L’absorbance à 260 nm d’une extraction d’ADN ayant subi un traitement à la RNase n’a pas toujours seulement de l’ADN. Pourquoi?

Answer 22

Car le traitement ne fonctionne pas toujours bien.

Question 23

Si le rapport 260/280 est supérieur à 2,5 — 3,0 , ça nous indique quoi?

Answer 23

Que la solution pourrait être contaminé par une ou des substance(s) non identifiée(s) qui absorbent aussi à 260 nm.

Question 24

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Comment fait-on pour déterminer si la solution est contaminée par de solvants organiques, que doit-on faire?

Answer 24

Il faut prendre une troisième lecture à 230 nm et faire un rapport 260/230. Ce rapport devrait d’approcher de 2 S’il y a absence de contamination.

Question 25

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Donc, quelle est la valeur du rapport 260/280 si l’extraction est contaminée par des protéines?

Answer 25

< 1.75

Question 26

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Donc, quelle est la valeur du rapport 260/280 si l’extraction contient de l’ADN pur?

Answer 26

= 1.75 à 1.9

Question 27

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Donc, quelle est la valeur du rapport 260/280 si l’extraction contient de l’ARN?

Answer 27

Plus grand ou égale à 2.0

Question 28

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Donc, quelle est la valeur du rapport 260/280 si l’extraction contient des produits non identifiés?

Answer 28

> 3.0

Question 29

Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN : Quelle est la formule qu’on doit utiliser pour calculer la concentration d’ADN d’une solution?

Answer 29

Une solution contenant 50 µg/ml d’ADN double brin sans contamination donne une absorbance de 1.0 au spectrophotomètre à une longueur d’onde de 260.

Formule : 50 µg/ml = 50 ng/µl d’ADN = 1,0 Absorbance260.

Question 30

Purification de l’ADN : Quelle est la méthode conventionnelle pour purifier un échantillon d’ADN?

Answer 30

C’est la déprotéinisation: ça consiste à éliminer les protéines contenues dans l’échantillon tout simplement.

Question 31

Purification de l’ADN : Que fait le mélange phénol-chlorophorme-alcool isoamylique autrement appelé mélange phénol-chloroforme?

Answer 31

En présence de ce mélange, on peut observer la présence de protéines dans un échantillon d’ADN par l’observation d’une interphase après centrifugation.

Question 32

Purification de l’ADN : Après le traitement par le phénol-chloroforme, que doit-on faire?

Answer 32

Répéter le traitement jusqu’à ce qu’il n’y ai plus d’interphase visible.

Question 33

Purification de l’ADN : Quelles sont les 5 étapes à suivre pour la purification d’ADN par une extraction avec le mélange phénol-chloroforme (déprotéinisation)?

Answer 33

1. À un volume donné d’une solution d’ADN, ajouter un volume d’un mélange de phénol-chloroforme.
2. Mélanger au Vortex pendant 5 à 10 secondes.
3. Centrifuges 5 minutes
4. Prélever la phase aqueuse (supérieure). Faire attention de ne pas prélever ou toucher ni la phase organique ni l’interphase. Les protéines se trouvent dans l’interphase.
5. Précipiter l’ADN selon la méthode du labo 1.

Question 34

Purification de l’ADN : Avec quelle solution la putification de l’ADN se fera-t-elle dans le laboratoire?

Answer 34

Avec une solution saline.

Question 35

Purification de l’ADN : Comment peut-on déportéiniser l’échantillon avec une solution saline?

Answer 35

Le principe est de traiter uniquement le lysat cellulaire par une solution saline.
Cette solution élimine par précipitation sélective les protéines. En fonction des protocoles, des étapes de prétraitement par la RNase sont proposées. Différentes solutions salines ont été préconisées : par exemple, NaCl 2.5M.