Labo 4 théorie et powerpoint : Précipitation et digestion de l'ADN amplifié et analyse du rendement et de la qualité de l'amplification du gène de la profiline Flashcards
Le rendement d’une réaction de PRC est variable mais se situe normalement entre quelle et quelle quantité d’ADN?
Entre 100 ng et 2 µg d’ADN.
Est ce que c’est le rendement pour les petits fragments ou les longs fragments qui est le meilleur?
C’est le rendement des petits fragments qui est meilleur.
Que permettent le développement des polymérases génétiquement modifiées?
Elles sont plus performantes et permettent de réaliser des PCR sur des fragments de taille allant jusque 20Kb.
Lors d’une réaction d’amplification par PCR, si on n’obtient pas d’ADN, que doit-on faire?
- Vérifier la présence de tous les éléments nécessaires à la réaction.
- Vérifier la qualité et quantité d’ADN de départ (si la quantité d’ADN est trop grande ou si l’ADN utilisé est dégradé, il n’y aura pas de réaction).
Normalement, on devrait obtenir combien de fragments d’amplification après une réaction de PCR?
Un seul fragment.
Si on a plusieurs bandes, ça veux dire quoi?
Que la réaction a probablement été non spécifique.
Pour éliminer le problème d’une réaction non spécifique, que doit-on faire?
On peut utiliser les mêmes oligonucléotides mais en diminuer la concentration de MgCl2 dans la réaction.
Si le fait de diminuer la concentration de MgCl2 dans la réaction n’élimine pas les bandes non-spécifiques, il faut faire quoi?
Changer la composition de nos oligonucléotides car ils s’hybrident probablement à plusieurs sites différents dans l’ADN.
Après une amplification PCR, l’ADN est quelques fois précipité. À quoi peut servir la précipitation de l’ADN?
À concentrer l’échantillon, à changer le tampon ou à éliminer les nucléotides non incorporés.
C’est quoi un isoschizomer?
Une enzyme de restriction qui reconnaît le même site de coupure et le coupe de façon identique à une autre enzyme.
ex: GGTACC est coupé par 2 enzymes, mais les extrémités des fragments obtenus sont différents.
Faire une digestion avec 2 enzymes est possible. Mais si elles nécessitent le même tampon. Il faut au moins une digestion efficace à combien de % ?
Efficace à au moins 50%, mais 100% est idéale.
Pour quelle raison précipite et lave-t-on l’ADN amplifié?
- éliminer les nucléotides non incorporés (dNTP)
- enlever les enzymes et les sels (nettoyer)
- concentrer l’échantillon
- Nécessaire si on souhaite changer de tampon.
