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5. Bio mol (labo) > Labo 1 théorie : préparation d'ADN. > Flashcards

Labo 1 théorie : préparation d'ADN. Flashcards

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Biology 101 flashcards
1
Q

Précipitation de l’ADN : Pour précipiter de l’ADN quelles sont les 2 substances et leur concentration qu’il faut rajouter à la solution d’ADN?

A

0.1 vol d’acétate de sodium (par exemple)
+
2 vol d’alcool éthylique à 95% (sur la glace).

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Q

Précipitation de l’ADN : Quelles sont les 3 autres substances que l’on peut utiliser au lieu de l’acétate de sodium?

A
  • L’acétate d’ammonium 2,0 M,
  • Le chlorure de lithium 0,8 M ou
  • Le chlorure de sodium 0,2 M.
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3
Q

Précipitation de l’ADN : La présence de sels utilisés lors de la précipitation est nécessaire pour quoi?

A

Pour assurer une solubilisation efficace du culot d’ADN dans le tampon TE ou dans l’eau propre et à pH neutre.

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Q

Précipitation de l’ADN : Que fait le tampon TE?

A

Tris : conserve l’intégrité et la stabilité de l’ADN.

EDTA : inhibe les nucléases.

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5
Q

Précipitation de l’ADN : Après l’ajout des cations monovalents (soit l’acétate de sodium par exemple) et de l’alcool éthylique à 95%, que doit-on faire?

A

Laisser précipiter sur la glace pendant environ 10 minutes (pour l’ADN concentré) ou pour plus longtemps (ADN peu concentré).

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6
Q

Précipitation de l’ADN : Après avoir laissé la solution d’ADN se précipiter sur la glace, que doit-on faire ensuite?

A

Centrifuger!!

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7
Q

Précipitation de l’ADN : Est ce que la durée de la première centrifugation est importante? Pourquoi?

A

Oui, car il faut un temps de centrifugation suffisante pour pouvoir recueillir de faibles concentrations d’ADN sous forme de culot.

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8
Q

Précipitation de l’ADN : Combien de temps doit durer la première centrifugation?

A

Entre 10 et 15 minutes à vitesse maximale!

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9
Q

Précipitation de l’ADN : Après la première centrifugation, que faire par la suite? Et pourquoi doit-on faire ça?

A

Il faut retirer le surnageant et faire un lavage à l’alcool éthylique 95% pour éliminer les sels restants et pour assécher le culot.

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10
Q

Précipitation de l’ADN : Après le lavage à l’alcool éthylique 95% pour éliminer les sels et assécher le culot, que doit-on faire?

A

Laisser évaporer complètement l’alcool et dissoudre le culot dans la solution tampon TE ou l’eau.

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11
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : À quoi ça sert de faire une électrophorèse sur gel d’agarose ou de polyacrylamide?

A

Ça sert à séparer les molécules linéaires d’ADN selon leur taille.

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12
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : À quoi sert le gel lors de cette expérience?

A

Il agit comme un tamis moléculaire.

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13
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Comment est ce que le gel agit comme un tamis pour les molécules d’ADN linéaire?

A

Plus les molécules d’ADN sont longues, plus leur migration à travers les pores se fait avec difficulté et inversement.

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14
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Quelle est la différence entre les pores du gel d’agarose de 0,5% à 1,5% (P/V) et les pores du gel de polyacrylamide?

A

C’est que les pores du gel d’agarose sont plus grands que ceux du gel de polyacrylamide .

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15
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Quand est-il préférable d’utiliser le gel d’agarose et quand est-il préférable d’utiliser le gel de polyacrylamide?

A

Gel d’agarose : pour séparer des fragments de 0,2 à 30 kb

Gel de polyacrylamide : pour séparer des fragments de 1 à 500 nucléotides.

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16
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : D’où provient l’agarose dans la nature?

A

C’est un polysaccharide qui est extrait des algues rouges.

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17
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Comment fait-on pour dissoudre l’agarose?

A

On mélange l’agarose à une solution tampon à pH légèrement alcalin et on le bouille pour dissoudre l’agarose.

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18
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Quel est la solution tampon à pH légèrement alcalin qui est le plus souvent utilisé pour dissoudre l’agarose?

A

Normalement c’est le tampon de migration TBE 1X à pH 8,0.

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19
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Quelles sont les autres solutions, à part le tampon de migration TBE 1X, qui sont utilisés pour dissoudre l’agarose?

A
  • SB 1X
  • TAE 1X
  • TBE + SB 1X
20
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Après avoir dissout l’agarose dans la solution tampon, que faire?

A

(On met une petite quantité de bromure d’éthydium), on verse le mélange dans un support horizontal et on le laisse se solidifier.

21
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Après que le gel se solidifie, quoi faire?

A

On submerge le gel dans la même solution tampon que qui a été utilisé pour dissoudre l’agarose.

22
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Que contient la solution tampon de migration? Et à quoi sert-elle?

A

Il contient des ions (électrolytes) qui le rendent permissif pour faire passer un courant électrique.

23
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Quel est le pH de la solution tampon de migration? Et à quoi sert ce pH spécifique?

A

Le pH est basique.

Et ça charge l’ADN négativement!

24
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Quelles sont les 2 principales fonction s du tampon de chargement 6X?

A
  1. Permettre de visualiser le front de migration grâce au bleu de bromophénol.
  2. Agmenter la poussée d’Archimède (l’alourdir) de l’échantillon pour lui permettre de descendre et de rester dans le fond du puits grâce au glycérol.
25
Q

Quel est l’avantage de prendre le tampon de chargement 6X pour visualiser le front du migration de l’ADN?

A

C’est que le tampon de chargement 6X va migrer à la même vitesse que les fragments de 250 à 350 pb dans le tampon TBE 1X + SB 1X.

26
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Que représente le nombre de X dans une solution tampon?

A

À sa concentration.

27
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Pourquoi est ce que le tampon de migration doit être à 1X?

A

Quand on fait une réaction ou un mélange pour déposer un échantillon sur gel, il faut tenir compte de la concentration du tampon et calculer (C1V1=C2V2) pour que le tampon devienne du 1X dans le volume final.

28
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : lors de la migration, vers où est ce que l’ADN va migrer?

A

De la charge négative (-) à la positive (+).

29
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : La vitesse de migration de l’ADN dépend de quoi? (3)

A
  • Du voltage appliqué,
  • De la masse moléculaire et
  • De la conformation de l’ADN.
30
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Décrire la migration pour des molécules d’ADN linéaires.

A

La migration est inversement proportionnelle à la taille en nombre de nucléotide de l’ADN.

31
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Comment fait-on pour déterminer la taille du fragment d’ADN (en pb)?

A

C’est en comparant la distance de migration de notre ADN à la distance de migration des fragments qui constitue la solution de marqueurs de taille utilisée.

32
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : À des voltages faibles, la vitesse de migration de l’ADN linéaire est proportionnelle à quoi?

A

Au voltage utilisé.

33
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Quelle est la conséquence d’utiliser un voltage élevé lors de la migration?

A

La mobilité de l’ADN de haute masse moléculaire augmente plus que la migration de l’ADN de faible masse moléculaire, ce qui diminue la résolution.

34
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Quel est le voltage maximal pour avoir la meilleure résolution?

A

5 V/cm. (cm = distance entre les électrodes).

35
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : À quoi est ajustée la tension lors de la migration pour des analyses de routine sur des mini-gels dans le tampon TBE 1X + SB 1X?

A

La tension est ajustée à 120 Volts.

36
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Que peut-on visualiser lorsque la migration est terminée?

A

Les fragments d’ADN qui ont incorporé le promure d’éthidium contenu dans le gel.

37
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Qu’est ce que le bromure fait à l’ADN dans le gel lors de la migration?

A

Il s’intercale dans les bases d’ADN grâce à sa forme plane et quand il est exposé à une lumière UV, il émet de la fluorescence. Ceci permet de visualiser et photographier les fragments d’ADN.

38
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Pourquoi y a-t-il des zones de restriction pour le bromure au laboratoire? Qu’y a-t-il de dangereux avec le bromure?

A

Car le bromure d’éthidium est un agent mutagène donc il faut le manipuler avec précaution!!

39
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Quelle concentration de bromure fournie par les techniciens et quelle est la concentration nécessaire de bromure pour visualiser l’ADN?

A

Concentration fournie : 5 mg/ml.

Nécessaire : 0,5 µg/ml l.

40
Q

Électrophorèse sur gel d’agarose : Quelle est la concentration finale de bromure d’éthidium?

A

La concentration finale sera une dilution d’environ 1/10 000 de la dilution concentrée.

41
Q

Quantification de l’ADN sur gel d’agarose : L’intensité de la coloration d’une bande d’ADN par le bromure d’éthidium est porportionnelle à quoi?

A

À la quantité d’ADN contenu dans cette bande.

42
Q

Quantification de l’ADN sur gel d’agarose : Comment fait-on pour déterminer la quantité d’ADN contenu dans un échantillon?

A

C’est en comparant d’abord l’intensité de la fluorescence.

43
Q

Quantification de l’ADN sur gel d’agarose : À quoi sert le marqueur de taille?

A

Sert à estimer la quantité d’ADN dans un échantillon et pour estimer la taille de l’ADN en pb.

44
Q

Comment fait-on pour déterminer la concentration “exacte” d’ADN dans l’échantillon?

A

Avec un spectrophotomètre.

45
Q

Coloration du culot d’ADN : À quoi sert le coprécipitant rose?

A

Il précipite de la même façon que les acides nucléiques en présence d’un alcool. Ça permet de voir facilement l’emplacement du culot lorsque les quantités d’acides nucléiques sont infimes.

46
Q

Coloration du culot d’ADN : Cette technique de coloration est compatible avec quoi?

A 
Avec plusieurs techniques de biologie moléculaire telles que : 
- Gel d’électrophorèse. 
- Les amplification par PCR.
- Le séquençage d’ADN.
- Les digestions avec des enzymes de restriction. 
- La ligature
- La transformation 
etc…

5. Bio mol (labo) (11 decks)

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