Labo 3 théorie : les enzymes de restriction Flashcards
Les enzymes de restriction : Les enzymes de restriction sont importants dans quelles techniques de biologie moléculaire? (4)
- Cartographie physique de gènes ou d’ADN complémentaire
- Transferts de type Southern
- Clonage moléculaire
- analyse de séquences d’ADN.
Les enzymes de restriction : Comment appelle-t-on les produits de la digestion d’un génome ou d’un segment d’ADN par une enzyme de restriction?
Des fragments de restriction.
Les enzymes de restriction : Comment est ce que les fragments de restriction peuvent être séparés selon leur taille?
Par électrophorèse.
Les enzymes de restriction : Qu’est ce que les enzymes de restriction (qui sont des endonucléases) peuvent faire?
- Reconnaissent des sites particuliers sur l’ADN bicaténaire et coupent la molécule à ces sites.
- Couper l’ADN à des sites de quatre à huit paires de bases qu’elles reconnaissent spécifiquement.
- Digérer l’ADN étranger provenant d’une infection ou d’une transformation.
Les enzymes de restriction : Qu’est ce que les enzymes de restriction (qui sont des endonucléases) ne peuvent pas faire?
- Incapable de couper leur propre ADN qui est protégé par des groupements méthyles aux sites de reconnaissance.
Les enzymes de restriction : C’est quoi un palindrome?
- C’est une suite de 4 ou 5 acides nucléiques qui se lit de façon identique sur les deux brins.
- Ils ont un axe de symétrie rotatoire au centre de leur séquence.
Les enzymes de restriction : Dans un palindrome, quand le site de coupure correspond à l’axe de symétrie, comment appelle-t-on l’extrémité libérée des fragments de restriction?
“Franche”
Les enzymes de restriction : Dans un palindrome, on dit que l’extrémité coupée est cohésive quand quoi?
Quand le site de coupure n’est pas dans l’axe de symétrie.
Les enzymes de restriction : Quelle est la particularité des extrémités cohésives?
Elles peuvent se réassocier par liaisons hydrogène entre les bases complémentaires libres.
Les enzymes de restriction : Que font les enzymes de restriction de type II ?
Ils se lient et coupent des séquences spécifiques de l’ADN double brin.
Les enzymes de restriction : Les enzymes de restriction vont reconnaitre des suites de combien de nucléotides?
4, 5 ou 6 nucléotides.
Les enzymes de restriction : Avec quelle solution est ce que la digestion de l’ADN est effectuée?
Avec une solution tampon dont la composition en sel varie selon l’enzyme. (Concentration 10X est fournie par le manufacturier)
Les enzymes de restriction : À quelle température et pendant combien de temps est ce que la plupart des digestions sont effectuées?
à 37°C pendant 1 à 2 heures.
Les enzymes de restriction : Comment est-il possible d’effectuer une digestion en moins de 15 minutes?
Avec le développement de tampons plus performants et en les combinants avec des enzymes de restriction génétiquement modifiées.
Les enzymes de restriction : Une unité d’enzyme peut normalement digérer combien de µg d’ADN dans 1 heure?
1 µg
Les enzymes de restriction : Si on veut faire la digestion complète de l’ADN et en particulier si l’échantillon n’est pas très pur, quelle quantité d’enzyme doit on ajouter?
Une quantité 2 à 4 fois supérieure.
Les enzymes de restriction : Quelle est la condition pour que l’ADN puisse se faire digérer avec plus d’une enzyme à la fois?
Il faut que les enzymes soient actives dans la même solution tampon.
Les enzymes de restriction : Si on veut digérer l’ADN avec plus d’une enzyme et si les enzymes requièrent des solutions tampon différentes, quelles sont les 2 démarches possibles?
- Choisir une seule solution tampon qui permet une digestion de plus de 50% avec les deux enzymes
- Digérer avec la première enzyme dans la solution tampon appropriée. Après une heure, l’ADN est précipité, solubilisé dans la solution tampon recommandée et ensuite la deuxième enzyme est ajoutée.
Les enzymes de restriction : Lors de la digestion, si l’échantillon est trop dilué ou si les enzymes doivent être éliminés pour procéder à d’autres manipulations, que doit-on faire?
Une nouvelle précipitation!
Les enzymes de restriction : À quelle température et pendant combien de temps les enzymes sont-elles actives?
De 1 à 5 heures à 37°C.
Les enzymes de restriction : À quelle température et pendant combien de temps doit-on incuber l’ADN si on veut inactiver complètement les enzymes (note: ça ne fonctionne pas pour toutes les enzymes)?
Pendant 10 minutes à 65°C ou à 80°C.
Les enzymes de restriction : Quelle est la deuxième réaction qui doit suivre l’utilisation d’une enzyme de restriction thermostable?
C’Est une dé-protéinisation par le phénol chloroforme à l’aide d’une solution saline (cours 2).
Les enzymes de restriction : Quelles sont les précautions à prendre avec les enzymes de restriction?
- Il faut absolument les conserver à -20°C.
- Quand on veut les utiliser, il faut les sortir et les placer sur la glace.
- Il faut ensuite prélever le volume et le remettre immédiatement à -20°C.
- Éviter de contaminer les enzymes en utilisant toujours un embout propre à chaque prélèvement.
Les enzymes de restriction : Quand on digère un court fragment d’ADN (plasmide, un phage, virus, fragment PCR, etc.) on obtient un certain nombre de fragments de longueur déterminé. Pour estimer le nombre de fragments potentiels ou le nombre de coupures qui peuvent être obtenus suite à une digestion par une enzyme de restriction, il faut connaitre quoi? (3 choses).
- Connaître le nombre de bases que contient l’ADN.
- Connaitre le nombre de paires de bases qui sont reconnues par l’enzyme
- Connaitre la longueur en paire de bases du fragment de départ.
Les enzymes de restriction : Quand on veut estimer le nombre de fragments potentiels ou le nombre de coupures qui peuvent être obtenus suite à une digestion dans un court fragment d’ADN et que l’on connait les 3 choses que l’on doit connaitre, que faire par la suite?
Il faut prendre le nombre de bases et l’élever à la puissance du nombre de paires de bases reconnues par l’enzyme = ceci nous donne le nombre de paire de bases potentiel pour que se reproduise l’alignement de la même séquence de pb. Il suffit de diviser le nombre de pb du fragment de départ par ce chiffre.
Les enzymes de restriction : Quand on veut digérer l’ADN génomique d’un organisme, on obtient quoi sur un gel d’agarose?
Un ensemble de fragments de longueur variable qui donne l’allure d’une distribution hétérogène de fragments après la migration sur gel d’agarose.
Les enzymes de restriction : Après la migration sur gel d’agarose, que représente la présence de bandes d’épaisseur distincte à travers l’ADN hétérogène?
À des séquences qui sont répétées plusieurs fois.
Les enzymes de restriction : Après la digestion et suite à la migration sur gel d’agarose, comment fait-on pour déterminer la présence de contaminants d’ARN?
On repère facilement les fragments de l’ARN ribosomal par des bandes plus intenses sur le gel.
Les enzymes de restriction : Après la digestion et la migration, quelle est la meilleure indication qu’un ADN génomique sans contaminants d’ARN est bien digéré?
C’est avec la présence de fragments de longueur hétérogène (traînée).
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : Que permet la PRC?
Ça permet de sélectionner et d’amplifier à volonté n’importe quelle séquence à partir d’un mélange de fragment d’ADN.
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : Pour faire la PCR, que doit-on mélanger ensemble pour que ca fonctionne?
- Deux amorces (oligonucléotides) complémentaires aux extrémités du fragment d’ADN qu’on veut amplifier. (en grand excès)
- Des dNTPs
- Tampon réactionnel
- Solution de MgCl2
- ADN polymérase thermostable (Taq)
- Petite quantité d’ADN contenant la séquence à amplifier.
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : Comment se produit l’amplification à chaque cycle de la PCR?
Le nombre d’exemplaires de la séquence synthétisée par les deux amorces sont doublés à chaque reprise du cycle.
- Amplification exponentielle!
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : À quelle T° et pendant combien de temps est ce que l’ADN est dénaturé pour une réaction typique?
À 94°C ou 95°C pendant 5 à 10 minutes.
Amplification en chaîne par polymérase (PCR) : Après la dénaturation, les cycles de la PCR commencent. Quels sont les 3 cycles?
- 95°C pendant 30 secondes.
- 45°C et 65°C pendant 30 secondes pour permettre aux amorces de s’hybrider spécifiquement à l’ADN.
- 72°C pendant 30-60 secondes pour l’élongation des fragments.
