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Labo 2 powerpoint : préparation d'ADN 2 Flashcards

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Biology 101 flashcards
1
Q

Quels groupes d’êtres ont de l’ADN ou de l’ARN?

A
  • Les phages et virus
  • Les Archaea
  • Les bactéries (génomique ou plasmidique)
  • Les Eucaryotes (génomique (chromosomes) et organites)
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Q

Où peut-on trouver l’ADN dans la cellule animale?

A

Dans le noyau : ADN génomique

Dans les mitochondries : L’ADN mitochondiral.

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Q

Où peut-on trouver de l’ADN dans la cellule végétale?

A
  • Dans les mitochondries
  • Dans le noyau (nucléole)
  • Dans les chloroplastes
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4
Q

Les protocoles pour faire l’extraction cellulaire peuvent varier selon quoi?

A
  • Le type d’ADN que l’on veut extraire
  • La source d’ADN (bactérie, plante, etc.)
  • Le degré de pureté nécessaire pour l’application.
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5
Q

Quelles sont les 4 classes principales de méthodes d’extraction d’ADN?

A
  1. Adsorption : utilisation de microcolonnes de résine échangeuses d’ions ou silice —> kit commerciaux.
  2. Solvants organiques —> Phénol chloroforme
  3. Ultracentrifugation
  4. Méthode utilisant des solvants non-organiques —> solutions salines.
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6
Q

Décrire la méthode d’extraction d’ADN des kits commerciaux.

A
  • Il y a une colonne de purification.
  • L’ADN adhère à la résine ou à la silice de la colonne en présence des agents chaotropiques
  • Élution pour séparer l’ADN de la colonne avec le tampon TE ou H2O.
  • La phase aqueuse est récupérée et les acides nucléiques sont précipités dans l’alcool.
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7
Q

Décrire la méthode d’extraction d’ADN de l’ultracentrifugation en gradient de densité.

A
  • C’est une méthode alternative pour l’isolation de l’ADN, l’ARN et les protéines.
  • Pour les quantités industrielles.
  • Les éléments séparés se localisent au niveau de la densité qui est la plus proche de la leur.
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8
Q

Quelles sont les étapes pour faire l’extraction de l’ADN cellulaire?

A
  1. Briser les cellules
  2. Extraire l’ADN
  3. Précipiter et purifier l’ADN
  4. Éliminer l’ARN.
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9
Q

Quelles sont les méthodes pour briser les cellules?

A

Lyse de la paroi :

  • Méthodes mécaniques
  • Choc thermique
  • Méthodes enzymatiques.
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10
Q

Quelles sont les méthodes mécaniques pour briser les cellules?

A
  • Les billes de verre
  • Le pilon et le mortier
  • La sonication (ondes haute fréquence)
  • La presse Aminco-French.
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11
Q

Quelles sont les moyens pour briser les cellules avec un choc thermique?

A
  • Congélation / décongélation

- Ébullition

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12
Q

Quelles sont les moyens de briser les cellules avec des méthodes enzymatiques?

A
  • Lysozyme
  • Cellulase
  • Pectinase, pectolyase
  • Lyticase
  • Protéinase.
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13
Q

C’est quoi la lyticase?

A
  • Elle est isolée d’un actinomycète
  • Endo ß-1,3 glucanase et protéases
  • Enzyme qui hydrolyse la paroi cellulaire de la levure
  • Digestion par lyticase abime moins l’ADN qu’une lyse mécanique
  • Bon rendement.
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14
Q

Que se passe-t-il lors du premier traitement avec la lyticase?

A
  • Le tampon Sorbitol
  • Incuber 20 min à 30°C
  • Centrifuger (éliminer la paroi)
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15
Q

C’est quoi le SDS?

A

«Sodium Dodecyl Sulphate» ou «Laurylsulfate de sodium»

C’est un détergent qui détruit la membrane.

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16
Q

Comment est ce que le SDS détruit-elle la membrane?

A
  • Émulsifie les lipides et les protéines
  • Supprime les interactions polaires qui maintiennent la cellule
  • Forme un complexe avec les lipides et les protéines —> Précipitation.
17
Q

C’est quoi la Protéinase K?

A

Elle est isolé d’un ascomycète

  • Aucun effet d’hydrolyse sur les acides nucléiques
  • Hydrolyse les protéines de toutes origines
  • Préférence pour les liaisons peptidiques
  • Très active, même en présence de SDS ou d’EDTA.
18
Q

Qu’est ce que la protéinase K fait avec l’ADN et les histones?

A

Elle les sépare!!

19
Q

Pour les étapes de purification de l’ADN et l’élimination de l’ARN, nous cherchons la quantité et la qualité appropriée d’ADN. Quelle est la méthode la plus commune?

A
  • Mesurer l’absorbance (spectrophotomètre)

- Calculer le rapport d’absorbance 260/280.

20
Q

L’ADN et les protéines absorbent les rayonnements UV. Les acides nucléiques ont un maximum d’absorption à combien de nm?

A

260 nm

21
Q

L’ADN et les protéines absorbent les rayonnements UV. Les cotaminants protéiques absorbent à combien de nm?

A

280 nm

22
Q

Quelles sont les autres méthodes pour déterminer la quantité et la qualité de l’ADN?

A
  • Les agents intercalants comme le Bromure d’éthidium —> gel

- Fluorescence - fluoromètre

23
Q

C’est quoi un agent intercalant?

A

Une molécule capable de s’insérer entre les plateaux formés par les bases appariées d’un acide nucléique.

24
Q

En résumé, Quelles sont les étapes pour extraire et purifier l’ADN?

A
  • Briser la cellule pour libérer le contenu incluant le noyau.
  • Ouvrir le noyau pour libérer l’ADN
  • Protéger l’ADN contre les digestions enzymatiques
  • Purifier l’ADN pour le séparer des restes de la cellule
  • Estimer la quantité et la qualité de l’ADN.
25
Q

Lors du laboratoire, et lors de la digestion avec la protéinase K dans SDS, que se passe-t-il quand on a incuber à 55°C pour 20 minutes?

A

On a dénaturer les histones et la chromatine.

26
Q

Lors du laboratoire, après la digestion avec la protéinase K dans SDS, Qu’est ce qui se trouve dans le surnageant?

A

L’ADN.

27
Q

Lors du laboratoire, après la digestion avec la protéinase K dans SDS, Qu’est ce qui se trouve dans le culot?

A

Les protéines

28
Q

Lors du laboratoire, après la digestion avec la protéinase K dans SDS, que doit-on faire?

A

Transférer le surnageant dans des nouveaux microtubes et ajouter de l’isopropanol froid.

29
Q

Lors du laboratoire, après la digestion avec la protéinase K dans SDS et après l’ajout de l’isopropanol froid dans le surnageant, que doit-on faire?

A

À cette étape, on précipite l’ADN.

  • Laver l’ADN avec l’alcool éthylique
  • Sécher les culots
  • Solubiliser l’ADN dans le tampon TE
30
Q

Lors du laboratoire, et lors de la purification et la précipitation, qu’est ce qu’on a utiliser comme solution et a quoi servent-elles?

A
  • La solution saline (précipitation de protéines et polysaccharides)
  • Alcool (précipiter l’ADN)
  • Tampon TE (re-solubiliser et conserver l’ADN).

5. Bio mol (labo) (11 decks)

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