Labo 2 powerpoint : préparation d'ADN 2 Flashcards
Quels groupes d’êtres ont de l’ADN ou de l’ARN?
- Les phages et virus
- Les Archaea
- Les bactéries (génomique ou plasmidique)
- Les Eucaryotes (génomique (chromosomes) et organites)
Où peut-on trouver l’ADN dans la cellule animale?
Dans le noyau : ADN génomique
Dans les mitochondries : L’ADN mitochondiral.
Où peut-on trouver de l’ADN dans la cellule végétale?
- Dans les mitochondries
- Dans le noyau (nucléole)
- Dans les chloroplastes
Les protocoles pour faire l’extraction cellulaire peuvent varier selon quoi?
- Le type d’ADN que l’on veut extraire
- La source d’ADN (bactérie, plante, etc.)
- Le degré de pureté nécessaire pour l’application.
Quelles sont les 4 classes principales de méthodes d’extraction d’ADN?
- Adsorption : utilisation de microcolonnes de résine échangeuses d’ions ou silice —> kit commerciaux.
- Solvants organiques —> Phénol chloroforme
- Ultracentrifugation
- Méthode utilisant des solvants non-organiques —> solutions salines.
Décrire la méthode d’extraction d’ADN des kits commerciaux.
- Il y a une colonne de purification.
- L’ADN adhère à la résine ou à la silice de la colonne en présence des agents chaotropiques
- Élution pour séparer l’ADN de la colonne avec le tampon TE ou H2O.
- La phase aqueuse est récupérée et les acides nucléiques sont précipités dans l’alcool.
Décrire la méthode d’extraction d’ADN de l’ultracentrifugation en gradient de densité.
- C’est une méthode alternative pour l’isolation de l’ADN, l’ARN et les protéines.
- Pour les quantités industrielles.
- Les éléments séparés se localisent au niveau de la densité qui est la plus proche de la leur.
Quelles sont les étapes pour faire l’extraction de l’ADN cellulaire?
- Briser les cellules
- Extraire l’ADN
- Précipiter et purifier l’ADN
- Éliminer l’ARN.
Quelles sont les méthodes pour briser les cellules?
Lyse de la paroi :
- Méthodes mécaniques
- Choc thermique
- Méthodes enzymatiques.
Quelles sont les méthodes mécaniques pour briser les cellules?
- Les billes de verre
- Le pilon et le mortier
- La sonication (ondes haute fréquence)
- La presse Aminco-French.
Quelles sont les moyens pour briser les cellules avec un choc thermique?
- Congélation / décongélation
- Ébullition
Quelles sont les moyens de briser les cellules avec des méthodes enzymatiques?
- Lysozyme
- Cellulase
- Pectinase, pectolyase
- Lyticase
- Protéinase.
C’est quoi la lyticase?
- Elle est isolée d’un actinomycète
- Endo ß-1,3 glucanase et protéases
- Enzyme qui hydrolyse la paroi cellulaire de la levure
- Digestion par lyticase abime moins l’ADN qu’une lyse mécanique
- Bon rendement.
Que se passe-t-il lors du premier traitement avec la lyticase?
- Le tampon Sorbitol
- Incuber 20 min à 30°C
- Centrifuger (éliminer la paroi)
C’est quoi le SDS?
«Sodium Dodecyl Sulphate» ou «Laurylsulfate de sodium»
C’est un détergent qui détruit la membrane.
Comment est ce que le SDS détruit-elle la membrane?
- Émulsifie les lipides et les protéines
- Supprime les interactions polaires qui maintiennent la cellule
- Forme un complexe avec les lipides et les protéines —> Précipitation.
C’est quoi la Protéinase K?
Elle est isolé d’un ascomycète
- Aucun effet d’hydrolyse sur les acides nucléiques
- Hydrolyse les protéines de toutes origines
- Préférence pour les liaisons peptidiques
- Très active, même en présence de SDS ou d’EDTA.
Qu’est ce que la protéinase K fait avec l’ADN et les histones?
Elle les sépare!!
Pour les étapes de purification de l’ADN et l’élimination de l’ARN, nous cherchons la quantité et la qualité appropriée d’ADN. Quelle est la méthode la plus commune?
- Mesurer l’absorbance (spectrophotomètre)
- Calculer le rapport d’absorbance 260/280.
L’ADN et les protéines absorbent les rayonnements UV. Les acides nucléiques ont un maximum d’absorption à combien de nm?
260 nm
L’ADN et les protéines absorbent les rayonnements UV. Les cotaminants protéiques absorbent à combien de nm?
280 nm
Quelles sont les autres méthodes pour déterminer la quantité et la qualité de l’ADN?
- Les agents intercalants comme le Bromure d’éthidium —> gel
- Fluorescence - fluoromètre
C’est quoi un agent intercalant?
Une molécule capable de s’insérer entre les plateaux formés par les bases appariées d’un acide nucléique.
En résumé, Quelles sont les étapes pour extraire et purifier l’ADN?
- Briser la cellule pour libérer le contenu incluant le noyau.
- Ouvrir le noyau pour libérer l’ADN
- Protéger l’ADN contre les digestions enzymatiques
- Purifier l’ADN pour le séparer des restes de la cellule
- Estimer la quantité et la qualité de l’ADN.
Lors du laboratoire, et lors de la digestion avec la protéinase K dans SDS, que se passe-t-il quand on a incuber à 55°C pour 20 minutes?
On a dénaturer les histones et la chromatine.
Lors du laboratoire, après la digestion avec la protéinase K dans SDS, Qu’est ce qui se trouve dans le surnageant?
L’ADN.
Lors du laboratoire, après la digestion avec la protéinase K dans SDS, Qu’est ce qui se trouve dans le culot?
Les protéines
Lors du laboratoire, après la digestion avec la protéinase K dans SDS, que doit-on faire?
Transférer le surnageant dans des nouveaux microtubes et ajouter de l’isopropanol froid.
Lors du laboratoire, après la digestion avec la protéinase K dans SDS et après l’ajout de l’isopropanol froid dans le surnageant, que doit-on faire?
À cette étape, on précipite l’ADN.
- Laver l’ADN avec l’alcool éthylique
- Sécher les culots
- Solubiliser l’ADN dans le tampon TE
Lors du laboratoire, et lors de la purification et la précipitation, qu’est ce qu’on a utiliser comme solution et a quoi servent-elles?
- La solution saline (précipitation de protéines et polysaccharides)
- Alcool (précipiter l’ADN)
- Tampon TE (re-solubiliser et conserver l’ADN).
