Kromatografi - Pr.opparb, IS, Ulike separasjonsprinsipper

Question 1

hvordan foregår væske-væske ekstraksjon for prøveopparbeidelse?

Answer 1

Det som skjer er at vi har en byrette med to løsninger, den øverste er heksan/upolar, så har vi serum/polar løsnigen som har vitaminene vi er på utkikk etter. Vi rister prøven godt slik at de upolare vitaminene vil gå opp til heksanen. Så vil vi tappe vekk vannfasen/serume. Så står vi igjen med heksan og vitaminer som tappes ut i en annen bolle. Heksan er ikke så veldig egnet til kromatografisk måling så vi damper heksan bort så vi bare har de fettløslige vitaminene. Vitaminene kan bli løst opp i etanol som mobilfasen og dermed måles, bruker etanol siden vitaminene løser seg bedre opp i den enn heksan

Question 2

hvorfor bruker man derivatisering på eks fettsyrer?

Answer 2

– Brukes på stoffer som er lite egnet til
kromatografianalyse som fettsyrer
– blander fast fettsyre med metanol slik at vi lager flyktige, termisk stabile derivater som kan
analyseres på feks. GC, dette gir også bedre kromatografiske evner som fører til en bedre kromatogram

Question 3

hvordan kan man bruke kromatografi som en kvalitativ analyse?

Answer 3

• tR til identifikasjon av analytten (konstante betingelser)
– Må først finne tR til det rene stoffet –Analysere ukjent blanding og så finne tR som samsvarer med
det rene stoffet
– Kan da få en kvalitativ identifikasjon av stoffene i den ukjente løsningen

Question 4

hvordan brukes kromatografi som en kvantitativ metode?

Answer 4

bruker:
• Kalibrator uten tilsatt intern standard
• Kalibrator med tilsatt Intern standard (IS)
(IS har ikke som oppgave å være en kalibrator )

Question 5

hva er en intern standard og hvorfor bruker vi det?

Answer 5

En intern standard er et stoff som tilsettes
prøveløsningen i en kjent mengde for å korrigere
for :
• tap ved prøveopparbeidelsen
• forandringer i injisert volum
• forandringer under den kromatografiske
analysen

Question 6

tap av den interne standarden i en analyse tilsvarer tap av……..

Answer 6

pasientprøven, det vil si at om man taper 10% av den interne standarden så må man legge til 10% i pasientprøven, siden det er så mye man da har mistet av den også

Question 7

hvilket krav har man for en intern standard?

Answer 7

• Den må være separert fra andre stoffer i prøven
• Den må ha en retensjonstid nært målestoffet
• Den må oppføre seg som målestoffet (mht.
ekstraksjon, derivatisering osv..)
• Ikke være tilstede i prøven
• Være tilgjengelig i ren form
• Må være stabil
• Må tilsettes i en konsentrasjon som helst gir lik
topphøyde som målestoffet

Question 8

hvis en SF er upolar, hva burde da MF være?

Answer 8

polar slik at den går rett gjennom MF uten å reagere med den

Question 9

hva er de vanligste bruksområdene til fordelingskromatografi?

Answer 9

• Papir- og tynnsjiktskromatografi – Papir/folie (sjiktet) bærer av SF – Vann eller vann/organisk løsningsmiddel er MF

Question 9

hva er de vanligste bruksområdene til fordelingskromatografi?

Answer 9

• Papir- og tynnsjiktskromatografi – Papir/folie (sjiktet) bærer av SF – Vann eller vann/organisk løsningsmiddel er MF

Question 10

hvordan kan man skille forskjellige stoffer som har nesten helt like kokepunkt?

Answer 10

når man har prøver med ganske lik kokepunkt kan man se på hvor godt de binder seg til SF, forskjellige stoffer binder seg med forskjellig styrke til SF, de vil da bli separert basert på dette

Question 11

hva er separasjon i en HPLC avhenge av?

Answer 11

Separasjon avhengig av at stoffene har ulik
affinitet til adsopsjonsmiddelet (SF) og at
interaksjonen er reversibel

Question 12

hva er SF/MF i adsorbsjons kromatografi og hvordan separeres stoffer her?

Answer 12

Stasjonærfasen; eks silica
(glass), aluminiumoksid. 
Overflaten av silica har silanol grupper (-Si-OH) som 
kan adsorbere stoffer med 
svake polare funksjonelle grupper. 

Mobilfasen; en relativ upolar
organisk væske

Separerer etter; konkurranse
mellom stoff og MF om adsorpsjonssetene mht polaritet

Question 13

hvor benyttes og hva brukes adsorpsjon til?

Answer 13

Benyttes i :
•Tynnskiktskromatografi - TLC
• HPLC, normalfase kromatografi
• GC

Hva brukes metoden til?
• Sorterer stoffer til videre bruk
• Hurtigtest for å se om en har funnet riktig stoff – forskning
• Separasjon av lavmolekylære stoffer eller gasser

Question 14

hva består en ionebyttet kromatografi av?

Answer 14

• EN IONEBYTTER består av et uløselig bæremateriale (matrix)
med en kovalent bundet ionisk (ioniserbar) gruppe
(Fast-ionet).
• Til Fast ionet er det elektrostatisk bundet et mot-ion av
motsatt ladning. Dette utgjør Stasjonærfasen
• Mot-ionet kan byttes ut med andre ioner (fra prøven)
• Mobilfasen er vanligvis vannløsninger av salter, syrer eller
baser

Question 15

simpelt sakt, hva skjer i en ionebytter kromatografi?

Answer 15

man bytter mot ionet fra SF med ioner i MF (prøven)

Question 16

hvis du har 3 aminosyrer der 1 er mest ladet og 3 er minst ladet, hvilken av dem vil først bli eluert i ionebytter kromatografi?

Answer 16

nr 3 vil først gå siden det ikke krever mye av MF å bytte den med sine egne ioner, den som kommer sist er 1 siden den er sterkere bundet til SF enn 3

Question 17

hvilke bruksområder har ionebytter kromatografi?

Answer 17

Separasjon av:
• Aminosyrer
• Nukleinsyrer for molekylær analyse
• HBA1C (Glykosylert hemoglobin)
• Ulike Hb-varianter
• Produksjon av deionisert vann

Question 18

kort forklart: hva skjer i eksklusjonskromatografi?

Answer 18

Har en SF som er porøs kule, og stoffer med forskjellige størrelse, de små vil komme inn i hulrommene og reagere mer med SF, de store går rett forbi og blir eluert først, SF kan være agarose eller porøs glass

Question 19

hva er bruksområdet til eksklusjons kromatografi?

Answer 19

• Brukes mer til å skille og preparere stoffer enn de 
brukes analytisk.
• Kan skille store molekyler 
som proteiner eller 
nukleinsyrer fra salter eller 
oligonukleotider

Question 20

når brukes affinitets kromatografi?

Answer 20

Affinitetskromatografi benyttes oftest til
å rense ut enkeltstoffer, dvs stoffer med
spesielle egenskaper, fra en blanding.

Question 21

hvordan blir en ligan brukt i affinitets kromatografi?

Answer 21

Har en matrix som ikke reagerer og en ligand som sitter fast i matrixen. Liganden kan eks være antistoff. Tilsetter en prøve eks en antigen som passer til antistoffet (liganden), de kobler seg sammen og danner et kompleks, resten av væsken blir skylt ut slik at vi sitter igjen med komplekse.

Question 22

kan man bruke samme type ligand for alle prøvetyper?

Answer 22

nei, siden en ligand er spesialisert for et antistoff, tenk på det som at ikke alle antistoffer passer i alle antigener

Question 23

hva er forskjellen mellom affinitets og adsorpsjons kromatografi?

Answer 23

Forskjellen mellom dette og adsorpsjon er at man må ha helt spesifikke ligander for å få til noe i affinitets kromatografi ikke i adsorpsjon

Question 24

hvorfor bruker man kiral kromatografi?

Answer 24

• Kiral kromatografi er nødvendig når vi ønsker
å separere to stoffer som er nesten like: – Stoffene har lik størrelse
– Kan ikke separeres etter kokepunkt, ioniske
egenskaper

Question 25

hvordan fungerer kiral kromatografi?

Answer 25

Har kiral SF slik at enantiomeren som passer til molekylene som er festet til SF vil sette seg fast der mens de som ikke fester seg blir skylt bort, samme prinsipp for MF.

tenk på det sånn at hendene dine er enantiomerer, de er nesten like men du kan ikke få venstre hånda de i en høyre hanske eller høyre hånda i en venstre hanske. i prinsippe er det slik man skiller dem i speilkromatografi også. man har et molekyl (hanske) som bare passer til den ene enantiomeren slik at den andre ikke passer inn og dermed blir skylt bort

Question 26

hvorfor ønsker vi å skille to kirale molekyler fra hverandre? gi eksempler

Answer 26

Mennesker kan reagere svært forskjellig på slike kirale
stoffer. 
Eksempel:
 – Aspartam 
– den ene smaker søtt, den andre 
bittert 
– β-blokker
 – den ene brukes som hjertemedisin, 
den andre gir nyreskade
 – Thaledomid
– en er effektiv mot 
morgenkvalme for gravide, den andre gir fosterskade