Kromatografi - Pr.opparb, IS, Ulike separasjonsprinsipper Flashcards
hvordan foregår væske-væske ekstraksjon for prøveopparbeidelse?
Det som skjer er at vi har en byrette med to løsninger, den øverste er heksan/upolar, så har vi serum/polar løsnigen som har vitaminene vi er på utkikk etter. Vi rister prøven godt slik at de upolare vitaminene vil gå opp til heksanen. Så vil vi tappe vekk vannfasen/serume. Så står vi igjen med heksan og vitaminer som tappes ut i en annen bolle. Heksan er ikke så veldig egnet til kromatografisk måling så vi damper heksan bort så vi bare har de fettløslige vitaminene. Vitaminene kan bli løst opp i etanol som mobilfasen og dermed måles, bruker etanol siden vitaminene løser seg bedre opp i den enn heksan
hvorfor bruker man derivatisering på eks fettsyrer?
– Brukes på stoffer som er lite egnet til
kromatografianalyse som fettsyrer
– blander fast fettsyre med metanol slik at vi lager flyktige, termisk stabile derivater som kan
analyseres på feks. GC, dette gir også bedre kromatografiske evner som fører til en bedre kromatogram
hvordan kan man bruke kromatografi som en kvalitativ analyse?
• tR til identifikasjon av analytten (konstante betingelser)
– Må først finne tR til det rene stoffet –Analysere ukjent blanding og så finne tR som samsvarer med
det rene stoffet
– Kan da få en kvalitativ identifikasjon av stoffene i den ukjente løsningen
hvordan brukes kromatografi som en kvantitativ metode?
bruker:
• Kalibrator uten tilsatt intern standard
• Kalibrator med tilsatt Intern standard (IS)
(IS har ikke som oppgave å være en kalibrator )
hva er en intern standard og hvorfor bruker vi det?
En intern standard er et stoff som tilsettes
prøveløsningen i en kjent mengde for å korrigere
for :
• tap ved prøveopparbeidelsen
• forandringer i injisert volum
• forandringer under den kromatografiske
analysen
tap av den interne standarden i en analyse tilsvarer tap av……..
pasientprøven, det vil si at om man taper 10% av den interne standarden så må man legge til 10% i pasientprøven, siden det er så mye man da har mistet av den også
hvilket krav har man for en intern standard?
• Den må være separert fra andre stoffer i prøven
• Den må ha en retensjonstid nært målestoffet
• Den må oppføre seg som målestoffet (mht.
ekstraksjon, derivatisering osv..)
• Ikke være tilstede i prøven
• Være tilgjengelig i ren form
• Må være stabil
• Må tilsettes i en konsentrasjon som helst gir lik
topphøyde som målestoffet
hvis en SF er upolar, hva burde da MF være?
polar slik at den går rett gjennom MF uten å reagere med den
hva er de vanligste bruksområdene til fordelingskromatografi?
• Papir- og tynnsjiktskromatografi – Papir/folie (sjiktet) bærer av SF – Vann eller vann/organisk løsningsmiddel er MF
hva er de vanligste bruksområdene til fordelingskromatografi?
• Papir- og tynnsjiktskromatografi – Papir/folie (sjiktet) bærer av SF – Vann eller vann/organisk løsningsmiddel er MF
hvordan kan man skille forskjellige stoffer som har nesten helt like kokepunkt?
når man har prøver med ganske lik kokepunkt kan man se på hvor godt de binder seg til SF, forskjellige stoffer binder seg med forskjellig styrke til SF, de vil da bli separert basert på dette
hva er separasjon i en HPLC avhenge av?
Separasjon avhengig av at stoffene har ulik
affinitet til adsopsjonsmiddelet (SF) og at
interaksjonen er reversibel
hva er SF/MF i adsorbsjons kromatografi og hvordan separeres stoffer her?
Stasjonærfasen; eks silica (glass), aluminiumoksid. Overflaten av silica har silanol grupper (-Si-OH) som kan adsorbere stoffer med svake polare funksjonelle grupper.
Mobilfasen; en relativ upolar
organisk væske
Separerer etter; konkurranse
mellom stoff og MF om adsorpsjonssetene mht polaritet
hvor benyttes og hva brukes adsorpsjon til?
Benyttes i :
•Tynnskiktskromatografi - TLC
• HPLC, normalfase kromatografi
• GC
Hva brukes metoden til?
• Sorterer stoffer til videre bruk
• Hurtigtest for å se om en har funnet riktig stoff – forskning
• Separasjon av lavmolekylære stoffer eller gasser
hva består en ionebyttet kromatografi av?
• EN IONEBYTTER består av et uløselig bæremateriale (matrix)
med en kovalent bundet ionisk (ioniserbar) gruppe
(Fast-ionet).
• Til Fast ionet er det elektrostatisk bundet et mot-ion av
motsatt ladning. Dette utgjør Stasjonærfasen
• Mot-ionet kan byttes ut med andre ioner (fra prøven)
• Mobilfasen er vanligvis vannløsninger av salter, syrer eller
baser
simpelt sakt, hva skjer i en ionebytter kromatografi?
man bytter mot ionet fra SF med ioner i MF (prøven)
hvis du har 3 aminosyrer der 1 er mest ladet og 3 er minst ladet, hvilken av dem vil først bli eluert i ionebytter kromatografi?
nr 3 vil først gå siden det ikke krever mye av MF å bytte den med sine egne ioner, den som kommer sist er 1 siden den er sterkere bundet til SF enn 3
hvilke bruksområder har ionebytter kromatografi?
Separasjon av: • Aminosyrer • Nukleinsyrer for molekylær analyse • HBA1C (Glykosylert hemoglobin) • Ulike Hb-varianter • Produksjon av deionisert vann
kort forklart: hva skjer i eksklusjonskromatografi?
Har en SF som er porøs kule, og stoffer med forskjellige størrelse, de små vil komme inn i hulrommene og reagere mer med SF, de store går rett forbi og blir eluert først, SF kan være agarose eller porøs glass
hva er bruksområdet til eksklusjons kromatografi?
• Brukes mer til å skille og preparere stoffer enn de brukes analytisk. • Kan skille store molekyler som proteiner eller nukleinsyrer fra salter eller oligonukleotider
når brukes affinitets kromatografi?
Affinitetskromatografi benyttes oftest til
å rense ut enkeltstoffer, dvs stoffer med
spesielle egenskaper, fra en blanding.
hvordan blir en ligan brukt i affinitets kromatografi?
Har en matrix som ikke reagerer og en ligand som sitter fast i matrixen. Liganden kan eks være antistoff. Tilsetter en prøve eks en antigen som passer til antistoffet (liganden), de kobler seg sammen og danner et kompleks, resten av væsken blir skylt ut slik at vi sitter igjen med komplekse.
kan man bruke samme type ligand for alle prøvetyper?
nei, siden en ligand er spesialisert for et antistoff, tenk på det som at ikke alle antistoffer passer i alle antigener
hva er forskjellen mellom affinitets og adsorpsjons kromatografi?
Forskjellen mellom dette og adsorpsjon er at man må ha helt spesifikke ligander for å få til noe i affinitets kromatografi ikke i adsorpsjon
