Kromatografi: Detektorer og masse spektrometri Flashcards
hvorfor bruker man en detektor?
• En detektor skal gi en respons, et elektrisk
signal, for de stoffene som vi ønsker å identifisere Kromatogram /Massespekter
• Responsen skal være proporsjonal med
– Konsentrasjonen av stoff i mobilfasen
– Masse/ ladningsforholdet til stoffene i mobilfasen
• Det vil da være mulig å utføre kvantitative
analyser basert på måling av topphøyde/
areal/masse-ladning
hvilke detektorer kan man ha for HPLC?
– UV/Vis (absorbans) detektor (Spektrofotometer)
– MS (masse spektrometri)
– RI-detektor (refractive index, brytningsindeks
– Fluorescence
– Elektrokjemi
hva er viktig å tenke på når man bruker en absorbans detektor?
stoffene må være kromofore for at de kan detekteres
hvordan fungerer en Ri detektor?
man har en kyvette med to kamre (referanse celle og prøve celle) når man har eluent i begge kamrene er lysbrytningen = 0 siden de er helt like. men når man har tilsatt en prøve i eluenten i prøvekamre vil den få en annen lysbrytning som måles, det er dette som da forteller oss hvile stoffer vi har
hva er de vanligste detektorene for GC?
– FID (flamme ionisasjons detektor)
– MS (masse spektrometri)
hvordan fungerer en Flamme ionisasjons detektor (FID)
Komponenter blandes med hydrogen og luft og forbrennes i en flamme, da dannes det ioner og frie elektroner, i katoden vil dette detekteres og menge stoff vil da være proporsjonal med strømmen som vil gå, her er høyden på kurven det samme som mengde stoff man har, det motsatte av UV detektor
hva er viktige egenskaper en analytt må ha for å kunne brukes i MS?
Nødvendige egenskaper til analytten:
– Analytt må kunne komme i gassfasen
– Analytt må kunne ioniseres
hvilke tre prinsipper gjelder alle MS?
• Alle massespektrometre fungerer ved at:
– Det dannes ioner
– Disse ionene sorteres etter deres masse/ladning (M/Z)
– Det bestemmes mengde av dannede ioner i vakuum
hva vil det si at MS er en destruktiv teknikk?
det betyr at komponentene man måler vil bli destruert i løpet av analysen og kan dermed ikke brukes igjen
hvorfor er det viktig at man analyserer en komponent i vakuum i MS?
Grunnen til at man har i vakuum er for at ionene følger en jevn strøm, hadde det ikke vært vakuum ville ionene kræsjet med hverandre og evt, oksygen, og man ville fått enda en fragmentering som man ikke vil, da ville resultatene blitt feil
er MF til GC og LC kompatibel med MS? og hvorfor/ hvorfor ikke?
• GC: Mobilfasen er en gass og er derfor
kompatibel med MS
• LC: Mobilfasen er en væske – kan derfor
ikke føres direkte inn i vakuum.
– Ioniserings-teknikker: Løsningsmiddelet må
fordampes eller ioniseres før vakuumdelen i MS
hvilke deler, deler man vakuum pumpen i?
kilde, analyserer, detektor
hvordan dannes det ioner i kilden?
I inlet kommer det nøytrale molekyler fra kromatografen, her er det vakuum, molekylene knuses av filamenter ( tråd strukturer) filamente skyter ut elektroner og fragmenterer de nøytrale molekylene til positive og negative ioner. MS bruker vanligvis positive ioner. På enden har man en repeller (liten dings som er positivt ladet) når den settes på vil den skyve vekk de positive ionene gjennom samle delen som er negativt ladet videre til analysatoren, de negative ionene settes på en ione kollekter.
hva vil det si at vi får en hard ionisering?
hard ionisering vil si at det dannes mange ioner.
hva skjer ved en elektrospray ionisering?
prøven fra kolonnen vil settes under høy spenning for å ionisere dråpen, Nebulizer gass vil sprøyte prøve dråpene fra kolonnen inn i et kapillarrør. her vil prøvene deretter sprayes med varm nitrogen gass som fordamper bort all væske, slik at bare komponenten går inn i analysatoren
hva vil det si at vi har en myk ionisering?
myk metode siden den ikke danner så mange ioner
hvordan fungerer MALDI?
Her har man ikke en kromatografisk separasjon som andre metoder. Man har en prøve som blandes med en matriks som ofte er en uv absorberende komponent. Man legger dem på en metallflate og lar dem tørke inn. Brukes vanligvis for å bestemme dna, biomolekyler, peptider, bakterier, sukkerarter osv. når denne har tørket inn vil det settes på en pulserende laserstråle som vil krytalisere, fordampe osv matrixen. da vil prøven løsne opp også vil den ioniseres vha de varme gassene som dannes slik at man får dannet ioner
hvordan fungerer generelt detektorer?
Massen til de ioniserte molekylene og
fragmenter, separeres i en analysator etter
sitt masse/ladnings forhold (m/z) og
detekteres av en detektor
hvordan fungerer en Kvadrupol masseanalysator?
Brukes for å skille eks isomere molekyler. I ms 1 og 2 filtrerer vi ut enkelte ioner vi ikke skal ha og lar de molekylene vi skal ha (molekylioner) fortsette inn i kollisjonscelle, her skjer det ny fragmentering vha gasser og spenning inne i kollisjonsceller eks argon, og vi får datterioner, som da vil gå inn i ms2 der molekylene vi ikke har igjen vil bli filtrert bort , her trenger man ikke mye prøvearbeidelse, man trenger heller ikke så mye prøve og man kan analysere flere analytter samtidig
hvordan fungerer en trippekvadrupol instrument?
Brukes for å skille eks isomere molekyler. I ms 1 og 2 filtrerer vi ut enkelte ioner vi ikke skal ha og lar de molekylene vi skal ha (molekylioner) fortsette inn i kollisjonscelle, her skjer det ny fragmentering vha gasser inne i kollisjonsceller eks argon, og vi får datterioner, som da vil gå inn i ms2 der molekylene vi ikke vil ha bli filtrert bort
i en TOF, hva er det som gir molekylene kraft nok til å nå detektoren på toppen av røret dens?
det som gir molekylene fart er spenning og et elektrisk felt inne i røret
hva er et massespekter?
Relativ intensitet av ioner som funksjon av m/z verdi plottes vanligvis som et
histogram og kalles et massespektrum. Massespekteret sammenholdes med
spekter i databaser. «Mor-molekylet» kan gjenkjennes
hva er fragmentering av ioner avhenge av?
Ioniserte molekyler kan fragmentere i
mindre biter avhengig av molekylets
struktur og mengde energi tilført
hvilke 3 måter kan man lage et massespekter på?
• Full scan: Sveiper over et valgt masseområde og detekterer alle massene.
– Gir mye informasjon
– Kan plukke ut interessante masser i ettertid
– Sammenliknes med et massebibliotek
• SIM: Selektive ion monitoring
– Detekterer en valgt masse og man får bare det man ser etter
• MRM: Mulitple reaction monitoring
– Detekterer flere utvalgte masser
