HPLC og GC kromatografi

Question 1

hva er det HPLC og GC står for?

Answer 1

GC = Gass Chromatography
HPCL = High Performance Liquid Chromatography

Question 2

hva bruker man som MF i GC og HPCL?

Answer 2

i GC bruker man gass

i HPCL bruker man væske

Question 3

når benytter vi GC?

Answer 3

flyktige stabile komponenter
når man har stoffer med lavt kokepunkt
når man har små molekyler

Question 4

hva er noen fordeler med GC?

Answer 4

• «Tøff» analysemetode (tåler høy temp)
• Gass som mobilfase (bæregass)
• Gir hurtige analysesvar, høy oppløsningsevne og resultat i ng- og pg området.
• Kan lett automatiseres

Question 5

hvilke prinsipp er det gasskromatografi går ut på?

Answer 5

• Separasjon etter kokepunkt (viktig!)

• Fordelingskromatografi.
– Fordeling av prøvekomponentene mellom to faser.
- SF er vanligvis en væske som er kjemisk bundet til
overflaten av en bæresubstans .
- MF er en gass

Question 6

hvilket separasjons prinsipper er det viktige å tenke på når man har et polart og et upolart SF?

Answer 6

Har vi en upolar SF er seperasjon ved hjelp av kokepunkt det viktigste
Mens i en polar SF separeres stoffer både etter polaritet og kokepunkt

Question 7

forklar i store trekk hva som skjer i en gass kromatografor, bruk linken som hjelpemiddel
https://www.ntnu.no/wiki/download/attachments/121670330/image2018-8-17%2012%3A3%3A42.png?version=1&modificationDate=1534500224000&api=v2

Answer 7

vi har tilkoblet en regulerbare gassylinder denne har en trykk regulator. i den kan vi ha gasser som helium, nitrogen osv. gassen føres til en injektor med høy temperatur og forstøver ( gjør prøven til gass) prøven, denne vil blande seg med bæregassen slik at den kan komme seg gjennom kolonnen. Fra injektoren går det en tråd som danner en kolonne med forskjellige tykkelser avhenge av hvile test man skal kjøre. Denne går videre til en detektor som også har høy temperatur og som da detekterer de forskjellige komponentene som kommer

Question 8

hva er viktig å tenke på når man skal velge en løsemiddel for GC og hvorfor er dette viktig?

Answer 8

viktig at den har lav kokepunkt da den vil komme raskest ut av kromatoren, den første toppen på et kromatografi er vanligvis alltid løsemiddelet, av denne grunn kan vi da fjerne dette fra sluttresultatet.

Question 9

hvorfor brukes nitrogen som bæregass BS i MF i studentlabbene.

Answer 9

Helium er mest brukt, men problemet er at det blir vanskelig å fremskaffe helium. Nest beste er hydrogen siden den har god oppløsningsevne, problemet er at den er eksplosiv ved konsentrasjoner høyre enn 4%. argon og nitrogen er like gode men de gir fortsatt dårligere resolusjon enn de andre gassene nevnt. Nitrogenet som blir brukt er inert og den har høy renhet som en hvilkens om helst BS må ha.

Question 10

hva skjer ved split injeksjon?

Answer 10

Overskuddsgass ventileres ut

Question 11

hvor høy er vanligvis injektortemperaturen?

Answer 11

• 50° over kokepunkt hvis dette
er kjent
• 50° over kolonnetemp

Question 12

forklar hva som skjer i en injektor, bruk linken som hjelpemiddel
https://www.restek.com/globalassets/wp-blog-assets/septum-purge.jpg

Answer 12

nederst i injektoren er det en seal. Seal passer på at det ikke lekkes ut gass, skiftes med jevne mellomrom. Bæregassen kommer fra venstre og tar med seg prøven som blir injisert ved hjelp av en prøvenål. før prøven tilsettes vil gassen allerede ha tatt med seg eventuelle prøverester ut gjennom septum purge så den ikke påvirker resultatene til den nye prøven.
Når prøven og bæregassen blandes har vi split point, da kan vi innstille hvor mye av prøveblandingen skal inn i kolonnen, er det eks 20% går bare 20% inn og resten filtreres ut

Question 13

hva vil det si at vi har en splitinjeksjon med splitratio på 1:100?

Answer 13

det vil si kun 1 mL/min vil gå inn i kolonnen, 1 ml/min brukes som skyllegass og 98 mL/min blir filtrert bort

Question 14

hvor mye av gassen vil gå inn i kolonnen om vi setter inn 2mL/min gass ved en split-less injeksjon og hvor mye av den injiserte prøven vil fortsette til kolonnen?

Answer 14

1 ml/min gass og all prøve vil gå ned til kolonnen siden det er en splitless injeksjon

Question 15

hvis kromatografen i en splitless injeksjon ser dårlig ut, hva kan man gjøre for at den kan bli bedre? hvilke av grafene i linken under bør forbedres?
bruk linken under http://files.alfresco.mjh.group/alfresco_images/pharma/2018/08/20/8ec97f90-d2fe-41a2-be7b-761256e763c5/figure%204%20L.png

Answer 15

Ved c er det dårlig fokusering og
man kan være usikker på om det er andre topper under de store toppene, har muligheten til forbedring, den kan injisere prøven og vente med å åpne split ventilasjonen, eller så kan man ha solvent trapping, da har mann en start temperature som er 40 grader under kokepunkt til løsemiddelet og løsemiddelet er i væskeform i starten av kolonnen, analytten fanges i løsemiddelet og beveger seg som en mer konsentrert form gjennom kolonnen

Question 16

hva er forskjellen på en kapilær kolonne og en pakket kolonne i gass kromatografi?

Answer 16

Kapilær kolonne er et tynt rør dekket av en indre film av væske da er det viktig at SF ikke er en flyktig væske

i en pakket kolonne har man bare en fast fase inne i kolonnen

Question 17

hva er forskjellen på SCOT og PLOT kolonner?

Answer 17

SCOT har man fasepartikler på innsiden av røret som kan være dekket av væske
PLOT er det bare fast fase partikler

Question 18

hva er den generelle forskjellen på kapillær og pakket kolonner?

Answer 18

Kapillær kolonne
• Høy oppløsning/effektivitet
• Kort analysetid
• Høy sensitivitet
• Mindre kapasitet
• Analytisk

Pakket kolonne
• Lav oppløsning/effektivitet
• Lang analysetid
• Liten sensitivitet
• Stor kapasitet
• Preparativ

Question 19

Mindre kolonne diameter gir….

Answer 19

høyere trykk og bedre resolusjon

Question 20

Økt kolonnelengde gir…

Answer 20

lengre retensjonstid men bedre resolusjon

Question 21

Tykkere film med stasjonærfase gir…

Answer 21

lengre retensjonstid men bedre

resolusjon

Question 22

hvilke modifikasjoner er vanlig å tilføre SF?

Answer 22

Vanlige modifieringer er å tilføre enten metyl eller fenyl grupper
Har vi bare metyl får vi en upolar materiale
Tilsetter vi phenyl som er mer polar for vi et polart materiale
Er vi upolar har vi x=o da har vi ikke fenyl
Har vi fenyl sier vi at x=0.35

Question 23

hva er kolonne blødning og hvordan kan vi hindre dette?

Answer 23

Kolonnemateriale blir dekomponert slik at man får bakgrunns signal som ikke har noe med prøven din å gjøre
Når kolonnemateriale blir dekomponert
vil MF ta med seg kolonnemateriale og vi får bakgrunn signal.
Oksygen binder seg til silika grupper i kolonne veggen og fører derfor til dekomponering, dette skjer i økende grad med kolonnealder
For å stoppe dette kan vi unngå høyere temperaturer enn anbefalt, har man en tynn SF kan det også bedre dette, og man må ha ren gass som ikke inneholder oksygen. etter en hvis tid er det også lurt å bytte kolonnen

Question 24

hvorfor er kolonnetemperaturen vikitig?

Answer 24

• Kolonnetemperaturen styrer retensjonen av stoffene i kolonnen, slik at tR avtar når temp øker.
• Kolonnetemperaturen må være så høy at analysen utføres på kortest mulig tid uten at separasjonen av stoffene blir dårlig
• Temperaturgradient gir smalere bredbånd og lavere tR

Question 25

hvordan fungerer en FID

(flamme isolasjonsdetektor)?

Answer 25

Dette er en universal detektor for organiske stoffer, detekterer ikke uorganisek stoffer
Denne er avhenge av hjelpe gasser, trenger hydrogen og luft for at en flamme skal kunne brenne, når bæregassen med prøve komponenter fra prøve kommer hit, blandes det med hydrogen og går inn i flammen, denne delen av flammen er en anode, når komponenter kommer her frigjøres carbon atomer som går opp i katoden, da får man en strøm mellom dem, størrelse på målt signal er relatert til mengde komponent man har.

Question 26

hvilke prinsipper brukes i HPLC?

Answer 26

Fordelingskromatografi (viktigst)
– Fordeling av prøvekomponentene mellom to homogene
faser.
– SF er vanligvis kjemisk bundet til overflaten av en
bæresubstans (silika eller polymer)
– MF er en væske

Question 27

hvor varm pleier kolonnen å være i HPLC?

Answer 27

ca 55 grader

Question 28

hva er viktig å tenke på når man skal ha MF i HPLC?

Answer 28

• Valg av MF er avhengig av type prøve og kolonne
• HPLC-grad av løsemiddel
Høy renhet
– Må filtreres
– Alt oppløst O2 eventuelt andre gasser må fjernes
(Mobilfase/prøven/løsemiddelet må degasses)
• MF = eluent
– Sterk eluent gir kortere retensjonstid
(høy eluentstyrke)
– Kombinasjon av to eller flere løsemiddel kan gi bedre verdier

Question 29

hvorfor er pumpen i HPLC vikitig?

Answer 29

• Konstant trykk og mengde under analysen slik at vi kan reprodusere analysen
• Sammensetning av MF er lik/ulik
– Isokratisk eluering (MF har konstant konsentrasjon)
– Gradient eluering (varierende konsentrasjon av MF)
• Purge-ventil
– Pumper mobilfase gjennom systemet utenom kolonnen
– Høy hastighet (mL/min) for å fjerne luftbobler eller å skifte ut MF

Question 30

forklar hvordan Injeksjonssystemet fungerer i HPLC

Answer 30

Setter på en sprøyte med prøve, kan stå i load eller injektposisjon, står det i load sprøyter man inn prøven, prøven fyller hele prøve lupen til den dripper ut på andre siden, trykker man inn handelen mot injekt endrer den seg slik at MF kommer inn fra pumpen blander seg med prøven og trykker den gjennom slik at den til slutt havner inn i kolonnen, denne er presis og fungerer ved høyt trykk. Skyller godt gjennom slik at vi ikke får noen carryover fra andre prøver
https://cdn.sanity.io/images/0vv8moc6/chro
ma/7751b8e75adb99cc74c9fb9adab139f522b25280-989x679.png

Question 31

i en HPLC kolonne vil mindre partikkelstørrelse bety…….

Answer 31

bedre effektivitet

Question 32

hvilke detektorer har man for HPLC

Answer 32

• Spektroskopisk –UV/Vis
• MS

• RI-detektor
(brytningsindeks) • Fluoriserende

• Elektrokjemisk

Question 33

hva er forskjellen på Fixed-wavelength, variable-wavelength og diodearrey

Answer 33

Vi kan ha fixed wavelength der man bare har en bølgelengde, variabel bølgelengde der man kan endre bølgelengde underveis. Kan ha diodearray men de er dyre, så de er ikke aktuelle

Question 34

hva registrer man i en HPLC detektor?

Answer 34

Registrerer stoffer som har abs.max ved de ulike bølgelengdene

Question 35

hvordan er stasjonærfasen i væske-væske kromatografi?

Answer 35

SF er silikapartikler med væske på utsiden. Væsken er fysisk bundet til partiklen ved kovalent binding. Den reaktive delen er karbonskjeden er ofte C18=18 C atomer. det vil si at jo mer prøvemateriale er jo mer vil den reagere med SF og jo treigere vil den gå gjennom SF

Question 36

hva er revers fase i HPLC?

Answer 36

• Fordelingskromatografi der:
• SF er upolar (Karbon, silika)
• Vanlige stasjonærfaser: C18, C8
• MF er polare væsker slik som metanol, acetonitril eller vann
• Økende andel vann øker polariteten
• Mer upolare forbindelser har større retensjon i systemet (like løser
like)
• Mindre reaktiv SF enn normal fase (gir mindre tailing)
• Mest brukte system innen HPLC pr. i dag

Question 37

hva er det Retensjonen og resolusjonen påvirkes av?

Answer 37

• Mobilfasens sammensetning
• pH: Syrer blir minst retardert ved høy ph motsatt med baser

• Tilsetning av salter: Salter minsker løseligheten i MF, stoffer som absorberes til kolonnen gir mindre retensjon, bedre symmetri og mindre båndspredning ved eks baser

• Stasjonærfase: Stasjonærfase er gjerne lange hydrokarbonkjeder og materialer med polare overflate grupper, de gir mindre retensjon
• Temperatur: Øker man temperatur for man mindre retensjon

• Trykk: mindre retensjons tid

Question 38

gi noen forskjeller på HPLC og UHPLC?

Answer 38

UHPLC = Ultra High Performance LC
• Nyere instrumentering
• Kolonne diameter : 2 mm
• Trykk opp mot 1000 bar
Dette betyr: 
– Kortere retensjonstid
 – Kortere analysetid – Bedre resolusjon (oppløsning) 
– Lavere deteksjonsgrense

HPLC = High Performance LC
• Eldre instrumentering
• Kolonne diameter: 3 – 5 mm
• Trykk: 100 – 400 bar

Question 39

gi noen forskjeller på HPLC og GC

Answer 39

HPLC
• Kolonnelengde 2 – 30 mm, kan gi 
dårligere separasjon
• Stor variasjon av MF og SF gir 
flere muligheter
• Analyserer større og mer polare 
komponenter med høyt kokepkt.
• Benytter organiske væsker som 
mobil fase (ofte spesialavfall)

GC
• Kolonnelengde 10 – 30 m, gir 
bedre separasjon
• Analyserer komponenter med 
lavt kokepkt., termisk stabile, må 
ofte derivatiseres
• Billigere drift og gir mindre farlig 
avfall

Question 40

Når bruker vi kromatografi som analysemetode?

Answer 40

• Legemidler
• Rusmidler
• Toksiner
• Hormoner
• Vitaminer
• Fettsyrer
• Metabolitter
• Dopingkontroll