Introduction au clonage moléculaire Flashcards
Qu’est-ce que le clonage moléculaire?
L’amplification d’un fragment d’ADN par des microorganismes après son insertion dans un vecteur.
Quelles sont les grandes étapes pour la production d’un ADN recombinant?
- Extraction des plasmides bactériens
- Ouverture du plasmide par une enzyme de restriction
- Extraction ou synthèse du gène ou de l’ADN d’intérêt
- Ligation de l’ADN d’intérêt avec le plasmide ouvert
- Réintroduction des plasmides dans des bactéries (transformation)
- Reproduction de l’ADN d’intérêt par la bactérie
Qu’est-ce qu’un plasmide?
Molécule d’ADN double brin circulaire, présente à l’état naturel dans le cytoplasme de
certains types de bactéries, capable de se répliquer et d’être transmis aux cellules filles. Un plasmide est
généralement plus petit que le chromosome bactérien.
Quelles sont les principales caractéristiques du plasmide?
Circulaire, double-brin, présent dans le cytoplasme de
plusieurs espèces bactériennes, réplication autonome, présence de divers gènes (résistance aux antibiotiques,
métaux lourds).
À quoi sert un vecteur? En quoi le plasmide est-il un vecteur?
Il sert de transporteur. Le plasmide peut transporter
des fragments d’ADN, il peut donc être un vecteur.
Quels sont les constituants essentiels d’un vecteur de clonage?
L’origine de réplication, un gène de sélection et un
site de clonage multiple.
En quoi l’origine de réplication est-elle essentielle au plasmide?
Elle permet la réplication autonome
(indépendante) et l’amplification du nombre de copies du vecteur.
Qu’est-ce qu’un polylinker? À quoi sert-il?
C’est un site de clonage multiple, c’est-à-dire une section du plasmide
contenant une multitude de sites reconnus par des enzymes de restriction. Il sert à « ouvrir » le plasmide pour y
ajouter un insert d’intérêt.
Est-ce que E.coli peut être dangereux pour ceux qui l’utilisent en biologie moléculaire? Expliquer.
Mais non! Ces souches utilisées en laboratoire sont dépourvues de caractère virulent.
Quels sont les organismes qui ont progressivement remplacé E.coli en biologie moléculaire?
Levure (Saccharomyces), mouche à fruit (drosophile), ver rond (Caenorhabditis elegans) et les cellules humaines
Qu’est-ce qu’une transformation bactérienne ?
En biologie moléculaire, c’est l’introduction d’ADN plasmidique dans une bactérie.
.Qu’est-ce qu’une cellule compétente ?
C’est une cellule apte à incorporer ou prélever du matériel génétique dans son environnement.
Quelles sont les façons d’obtenir la compétence ? Laquelle est la plus efficace ?
Acheter des cellules compétentes d’une compagnie ou utiliser une solution de chlorure de calcium.
La plus efficace : acheter d’une compagnie
Comment détermine-t-on l’efficacité d’une transformation bactérienne ?
Il s’agit du nombre de colonies obtenues sur milieu sélectif après transformation avec une quantité connue
d’ADN plasmidique.
Comment le choc thermique peut-il induire la transformation ?
En déstabilisant les couches lipidiques de la cellule bactérienne.
Comment l’électroporation peut-elle induire la transformation ?
Une impulsion électrique crée des pores dans la membrane de la bactérie.
Qu’est-ce qu’une mini-prep ?
C’est un procédé d’extraction d’ADN plasmidique sur un petit volume de culture bactérienne.
Quel est le rôle de la solution alcaline dans la miniprep ?
La dénaturation de l’ADN et des protéines.
Quel est le rôle du SDS dans la miniprep ?
La lyse cellulaire
Quel est le rôle de la solution d’acétate de potassium et de sel dans la miniprep ?
Acétate de potassium : Acidifier le milieu, renaturation des plasmides
Sels : Permet à l’ADN de se fixer au filtre de silice
Quel est le rôle du tampon EB dans la miniprep ?
Eluer l’ADN.
Quel est le rôle du tampon PB dans la miniprep ?
Éliminer les endonucléases
Pourquoi fait-on un lavage avec l’éthanol dans la miniprep?
Pour enlever les impuretés qui sont dans l’ADN plasmidique.
Quelles sont les façons de doser l’ADN dans un gel d’agarose?
Gel d’agarose, spectrophotométrie, colorants
fluorescents (Hoescht)
Quelle est la méthode la plus rapide pour doser l’ADN?
Spectrophotométrie
Quelle méthode est approximative pour doser l’ADN?
Agarose (comparer avec une échelle)
Quelle méthode faut-il privilégier si nous n’avons qu’une très faible quantité de matériel pour doser l’ADN?
Hoescht par fluorescence
Expliquer comment on peut détermine la concentration en ADN d’un échantillon inconnu par comparaison
visuelle.
On commence par déterminer la bande du marqueur qui a la même intensité que notre bande inconnue.
Ensuite, on détermine le pourcentage de la bande du marqueur (diviser la longueur de la bande par la longueur
totale du marqueur). On détermine ensuite la quantité d’ADN contenue dans la bande du marqueur en
multipliant le rapport qui vient d’être calculé par la quantité totale d’ADN du marqueur. Enfin, cette quantité
correspond à la quantité de notre bande inconnue, il faut diviser par le volume utilisé de notre inconnu pour
connaître la concentration.
