Étapes détaillées d'un clonage moléculaire Flashcards
Quelles sont les principales étapes d’un clonage moléculaire?
- Élaboration d’une stratégie de clonage
- Digestion du vecteur et de l’insert
- Purification du vecteur et de l’insert
- Déphosphorylation du vecteur
- Ligation de l’insert avec le vecteur
- Transformation bactérienne avec le produit de ligation
- Sélection et/ou criblage des transformants
- Identification des clones d’intérêt
- Entreposage des transformants
Quels sont les constituants essentiels d’un vecteur de clonage?
L’origine de réplication, un gène de sélection et un
site de clonage multiple.
En quoi l’origine de réplication est-elle essentielle au plasmide?
Elle permet la réplication autonome
(indépendante) et l’amplification du nombre de copies du vecteur.
Quelle est la différence entre un marqueur de sélection et un marqueur de criblage?
Le marqueur de sélection fait
en sorte que la bactérie qui l’a intégré peut vivre alors qu’autrement, elle mourrait. Seules les cellules ayant le
marqueur de sélection vont pousser.
Le marqueur de criblage permet de distinguer les cellules qui l’ont intégré (le marqueur) de celles qui ne l’ont pas
intégré. Toutes les cellules poussent donc avec le marqueur de criblage, mais sont différentes selon qu’elles l’ont
intégré ou non.
Pourquoi est-ce que ce sont les colonies blanches qui contiennent l’insert dans le système avec le marqueur lacZ?
Parce que l’insert est introduit à l’intérieur de gène lacZ et cela fait en sorte que la protéine (bêta-galactosidase)
associée n’est plus fonctionnelle, donc pas de production de pigment bleu en présence d’IPTG et de X-gal.
Expliquer la régulation de l’opéron lactose.
. L’opéron lactose est constitué d’un promoteur, d’un opérateur et de
gènes. Un gène régulateur produit constamment une protéine répresseur qui se fixe à l’opérateur et empêche la
fixation de l’ARN polymérase au promoteur. Lorsque l’inducteur est présent, il se lie au répresseur et l’empêche de
se lier à l’opérateur. L’ARN polymérase peut alors se lier au promoteur et débuter la transcription. Les gènes seront
alors transcrits, puis traduits pour donner naissance à différentes enzymes, dont la bêta-galactosidase.
Quelle différence y a-t-il entre un promoteur constitutif et un promoteur inductible?
Le promoteur constitutif
assure une transcription constante et régulière (peut être plus ou moins forte). Le promoteur inductible nécessite
la présence d’un inducteur pour que la transcription débute.
Quel est le rôle du terminateur dans le vecteur de clonage?
Il permet de stopper la transcription de façon
autonome. L’ARNm peut tout de suite être relâché, et un nouvel ARNm synthétisé.
Quand le marqueur nutritionnel est-il utilisé? Expliquer
Généralement lorsque nous avons besoin d’un deuxième
marqueur de sélection chez les vecteurs navettes (ceux qui sont utilisés chez deux organismes différents comme la
bactérie et la levure). Le marqueur est en fait un gène qui permet de synthétiser un métabolite essentiel qui n’est
normalement pas synthétisé par l’organisme utilisé. Ainsi, l’organisme ne pourra pas survivre dans un milieu sans
ce métabolite à moins qu’il n’ait intégré le gène (le marqueur) pour le fabriquer. Par exemple, une levure incapable
de synthétiser l’uracile ne pourra pas survivre dans un milieu sans uracile à moins d’avoir intégré un gène qui lui
permet de fabriquer l’uracile (le marqueur nutritionnel).
Qu’est-ce qu’un vecteur navette et que doit-il contenir de plus qu’un vecteur classique?
On appelle vecteur navette
un vecteur qui peut être maintenu dans des organismes différents. Il doit contenir une origine de réplication
supplémentaire et un marqueur de sélection supplémentaire.
Dans quelle situation l’insertion d’un épitope dans un vecteur de clonage peut-il être utile?
Lorsque l’objectif est la purification de protéines.
Quelle est l’utilité d’un marqueur de sélection dans un vecteur de clonage?
Pour sélectionner les cellules hôtes qui
ont incorporé le vecteur ou plasmide.
.Que sont les amorces universelles?
Ce sont des séquences trouvées chez plusieurs plasmides de clonage. Elles sont
utilisées pour le séquençage de l’insert ou pour le PCR (vérifier la longueur de l’insert).
Pourquoi serait-il intéressant d’utiliser des séquences d’amorces de part et d’autre du site de clonage multiple du
plasmide?
Pour pouvoir séquencer l’insert (connaître chacun des nucléotides de l’insert) et pour pouvoir amplifier
l’insert, c’est-à-dire en faire suffisamment de copies pour pouvoir les faire migrer et visualiser ensuite sur un gel
d’agarose et en déterminer la longueur approximative.
Quelles sont les considérations pour le choix du vecteur et de l’insert?
Le besoin ou non d’une étiquette, d’un
promoteur particulier ou non, de caractéristiques particulières ou d’un simple vecteur avec les composantes de base.
