Buvardage Flashcards
Que permet un Southern blot?
Permet la détection de l’ADN
Que permet un western blot?
Permet la visualisation des protéines
Quelles sont les grandes étapes du buvardage à la Southern?
- Choix d’une enzyme de restriction et digestion de l’ADN
- Migration de l’ADN sur gel
- Transfert de l’ADN sur membrane
- Fixation de l’ADN sur la membrane
- Hybridation avec la sonde
- Révélation de la sonde
Donner une utilité clinique du buvardage à la Southern :
Diagnostic de l’anémie ou toutes mutations qui font apparaître ou disparaître un site de restriction.
Quel est le principe du transfert par capillarité?
L’ADN dans le gel suit le tampon jusqu’à la membrane.
Quelles sont les principales caractéristiques d’une sonde nucléique ?
- Composée d’ADN ou d’ARN
- Complémentaire à une séquence cible
- Entre 15 et 1000 paires de bases
Expliquer le principe du marquage aléatoire en quelques lignes.
Utiliser un fragment d’ADN d’intérêt qu’on va dénaturer (simple brin) et répliquer avec la Klenow, des nucléotides marqués et des amorces aléatoires. Le produit final sera un mélange de fragments d’ADN marqué dont la séquence sera complémentaire à l’ADN matrice.
Expliquer le principe du marquage de sonde que vous avez réalisé en laboratoire.
Le principe est le marquage aléatoire par utilisation de molécules non radioactives. On utilise la digoxigénine comme marqueur de la sonde, puis un anticorps dirigé contre la digoxigénine et couplé à la phosphatase alcaline. Cette phosphatase, en agissant sur son substrat (BCIP/NBT) permettra l’observation d’un précipité bleu qui pourra confirmer la présence de la sonde (ADN marqué).
En quoi le marquage par PCR se distingue-t-il du marquage aléatoire ?
Le marquage par PCR nécessite l’utilisation d’une amorce spécifique, ce qui implique que la séquence
en amont ou en aval de la séquence d’intérêt doit être connue, contrairement au marquage aléatoire
où l’amorce est… aléatoire!
Comment peut-on marquer un fragment d’ADN qui possède une extrémité 3’ saillante ?
En transformant les extrémités saillantes avec la polymérase du phage T4. Son activité exonucléase 3’
vers 5’ dégrade les extrémités 3’ saillantes et son activité 5’ vers 3’ polymérase d’assurer que les
extrémités formées soient franches en présence d’un excès de nucléotides dont certains sont marqués.
Pourquoi est-ce que le marquage est constant peu importe la taille de la molécule pour le marquage
aux extrémités ?
Justement parce que le marquage se fait aux extrémités. Il n’y a pas plus d’extrémités que la molécule
d’ADN fasse 500 pb ou plutôt 3000 pb, donc pas plus de marquage. Ce n’est pas la même chose lorsque
les nucléotides marqués s’intègrent un peu partout dans les brins d’ADN puisque plus la molécule sera
longue, plus le marquage sera important.
Nommer des avantages des méthodes de détection non radioactives.
- Évite la manipulation de substances radioactives
- Évite la gestion des déchets
- Permet une amplification du signal
Pourquoi dit-on qu’il faut bien choisir le nucléotide marqué lors du marquage par incorporation pour
les extrémités 5’ saillantes libérées par une enzyme de restriction avec Klenow?
Parce qu’il faut prendre le temps de vérifier l’extrémité qui est produite avec l’enzyme de restriction et
choisir un nucléotide qui pourra compléter l’extrémité saillante produite. Autrement, l’extrémité ne
sera simplement pas marquée.
Qu’est-ce que la chimiluminescence ?
C’est l’utilisation de certaines réactions chimiques pour rendre possible l’émission de lumière,
généralement dans le spectre visible.
. Expliquer ce que vous avez fait en laboratoire pour fabriquer votre sonde d’ADN plasmidique
Dénaturation de l’ADN plasmidique extrait sur colonne par chauffage à 100 degrés Celsius.
Utilisation de la Klenow, de nucléotides marqués à la digoxigénine et d’amorces aléatoires pour
permettre de synthétiser des brins complémentaires marqués à la digoxigénine. Ces brins
complémentaires marqués sont les sondes qui serviront à l’hybridation subséquente.
